Um dos maiores problemas de saúde pública é o aumento da resistência a antibióticos em bactérias patogênicas. Em todo o mundo, há uma alta prevalência de resistência aos antibióticos beta-lactâmicos mediada por enzimas beta-lactamases. Por produzir duas beta-lactamases cromossômicas, AmpC e CphA, a bactéria oportunista ambiental Chromobacterium violaceum é intrinsecamente resistente a vários antibióticos beta-lactâmicos. No entanto, pouco se sabe sobre as vias de sinalização e regulação destas enzimas nesta bactéria. Neste estudo, isolamos mutantes espontâneos resistentes ao antibiótico ceftazidima para elucidar como essas beta-lactamases são reguladas. Por antibiograma, confirmamos a resistência a vários outros beta-lactâmicos em 13 destes mutantes espontâneos. Em 12 deles, ocorreu a hiperexpressão dos genes ampC e cphA, conforme verificado por ensaios de beta-galactosidase. O sequenciamento de DNA dos três genes parálogos da amidase AmpD de C. violaceum, uma enzima envolvida na reciclagem do peptideoglicano, revelou mutações de diferentes tipos em AmpD1 (CV_0566) na maioria dos mutantes espontâneos, mas não em AmpD2 ou AmpD3. Mutantes nulos simples e combinados dos genes das três amidases foram obtidos. A hiperexpressão de ambas as beta-lactamases e a aumentada resistência aos beta-lactâmicos foram verificadas apenas nos mutantes com deleção de ampD1. Quando introduzido nos mutantes nulos ou espontâneos de ampD1, o gene ampD1 reverteu os fenótipos destes mutantes. A amidase AmpD1 de C. violaceum possui arquitetura única entre as amidases bacterianas com presença de um domínio N-terminal de acetiltransferase. Três mutantes espontâneos foram escolhidos para sequenciamento completo do genoma (WGS). Os resultados revelaram mutações nos genes CV_1820 (RNAse E), CV_2060 (RseB, regulador negativo de sigma E) e CV_3538 (IspG, enzima de síntese de isoprenóides), sugerindo novas vias potencialmente envolvidas na resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. A mutação identificada por WGS na região intergênica do fator de transcrição CV_1922, na verdade, revelou-se um artefato decorrente da excisão do gene CV_1923, uma das cinco cópias de transposases encontradas em C. violaceum. Como alternativa, um ensaio de pull-down de afinidade ao DNA permitiu isolar diferentes proteínas que podem ser candidatos a reguladores transcricionais de ambas beta-lactamases. Em conclusão, nossos dados indicam que a ocorrência de mutações no gene da amidase AmpD1 é um mecanismo comum que leva a hiperexpressão das beta-lactamases AmpC e CphA e a alta resistência de C. violaceum a vários antibióticos beta-lactâmicos.

One of the biggest public health problems is the increase in antibiotic resistance in pathogenic bacteria. Worldwide, there is a high prevalence of resistance to beta-lactam antibiotics mediated by beta-lactamases enzymes. By producing two chromosomal beta-lactamases, AmpC and CphA, the environmental opportunistic bacterium Chromobacterium violaceum is intrinsically resistant to several beta-lactam antibiotics. However, little is known about the signaling and regulation pathways of these enzymes in this bacterium. In this study, we isolated spontaneous mutants resistant to the antibiotic ceftazidime to elucidate how these beta-lactamases are regulated. By antibiogram, we confirmed resistance to several other beta-lactams in 13 of these spontaneous mutants. In 12 of them, there was overexpression of the ampC and cphA genes, as verified by beta-galactosidase assays. DNA sequencing of the three paralogous genes of the C. violaceum AmpD amidase, an enzyme involved in peptidoglycan recycling, revealed mutations of different types in AmpD1 (CV_0566) in most spontaneous mutants, but not in AmpD2 or AmpD3. Single and combined null mutants of the three-amidase genes were obtained. Overexpression of both beta-lactamases and increased resistance to beta-lactams were observed only in mutants with ampD1 deletion. When introduced into ampD1 null or spontaneous mutants, the ampD1 gene rescued the phenotypes of these mutants. The AmpD1 amidase from C. violaceum has a unique architecture among bacterial amidases with the presence of an N-terminal acetyltransferase domain. Three spontaneous mutants were chosen for whole genome sequencing (WGS). The results revealed mutations in the genes CV_1820 (RNAse E), CV_2060 (RseB, a negative regulator of sigma E) and CV_3538 (IspG, isoprenoid synthesis enzyme), suggesting new pathways potentially involved in resistance to beta-lactam antibiotics. The mutation identified by WGS in the intergenic region of the CV_1922 transcription factor actually turned out to be an artifact resulting from the excision of the CV_1923 gene, one of the five copies of transposases found in C. violaceum. Alternatively, a DNA affinity pull-down assay allowed us to isolate different proteins that could be candidates for transcriptional regulators of both beta- lactamases. In conclusion, our data indicate that the occurrence of mutations in the AmpD1 amidase is a common mechanism that leads to the overexpression of the beta-lactamases AmpC and CphA and the high resistance of C. violaceum to several beta-lactam antibiotics.