Introdução: Os pênfigos representam doenças bolhosas autoimunes, geneticamente determinados por alelos HLA-DQ e -DR de susceptibilidade. Caracterizam-se pela produção de autoanticorpos da classe IgG contra desmogleínas (Dsg) - proteínas da família das caderinas, responsáveis pela adesão entre os queratinócitos -, e consequente acantólise intraepidérmica. São classificados em duas formas principais: pênfigo vulgar (PV) que acomete pele e mucosas devido à produção de anticorpos contra Dsg3 e Dsg1, respectivamente, e pênfigo foliáceo (PF), que acomete exclusivamente a pele por apresentar autoanticorpos anti-Dsg1. Cinco a 10% das células CD4+ do sangue periférico expressam CD25, e, destas, de 1% a 2% expressam níveis aumentados de CD25. Estas células têm propriedades reguladoras e são chamadas células Treg CD4+CD25high. Os linfócitos Treg naturais derivados do timo expressam constitutivamente, além do CD25, o gene Foxp3, e marcadores de superfície que não são específicos, mas auxiliam na caracterização dos mesmos, como CCR4 e CTLA4. As células T CD4+CD25high (Treg) têm a função de inibir clones de linfócitos autorreativos, tendo papel importante na autotolerância imunológica e modulação das respostas imunes. Em relação aos pênfigos, descreve-se redução de cerca de dez vezes do número de células Treg em relação ao total de células CD4+ em pacientes com PV, bem como da expressão de Foxp3, mas não em pacientes com PF, quando comparados aos controles normais. Objetivo: Verificar a expressão das Treg no PV e no PF. Material e Métodos: Foram incluídos 15 pacientes (8 PF; 7 PV) sem tratamento imunossupressor por pelo menos 60 dias antecedendo a coleta de sangue periférico ou biópsia de pele. Amostras de sangue de 12 pacientes (6 PF; 6 PV) e de 12 controles, pareados por idade, sexo e cor, foram submetidos à quantificação e fenotipagem de Tregs por citometria de fluxo, e amostras de 10 pacientes (5 PF; 5 PV) e de 10 controles pareados, ao ensaio de proliferação celular e cocultivo para investigar as propriedades funcionais das Treg. A determinação de alelos HLA- DQ e -DR foi realizada em 13 pacientes (6 PF; 7 PV). Para estudos de imunohistoquímica (IHQ) e microscopia confocal, coletou-se biópsias de pele lesada de 6 pacientes (4 PF e 2 PV), e de região perilesional de 5 pacientes (3 PF, 2 PV). Empregaram-se os testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney, e de Friedman e Wilcoxon para a análise da quantificação das células imunomarcadas e da função das Tregs, respectivamente. Considerou-se significância estatística α=0,05. Resultados: No grupo PV, a mediana da porcentagem das células Treg CD4+CD25high foi de 1%; no grupo PF de 1,01%; e nos controles 1,57%, havendo diferença entre os três grupos (p=0,009), cuja comparação múltipla de Dunn resultou significativa entre PF e controles (p=0,05), assim como entre PV e controles (p=0,02). Ao se agrupar pacientes com PF e PV, comparados aos controles, a porcentagem de Treg CD4+CD25high foi menor no grupo dos pênfigos (p=0,0013), bem como de células T CD4+CD25highFoxp3+ e de CD4+CD25highCCR4+ entre os pacientes comparados aos controles (p=0,001 e p=0,04, respectivamente). Nos ensaios de proliferação celular, não houve diferença na capacidade de Treg de pacientes e controles em inibir a proliferação de PBMC em co-cultivo. O alelo HLA DRB1*01:02, o mais frequentemente relacionado à susceptibilidade ao PF na população brasileira, esteve frequente em 3/6 pacientes com PF desse estudo. Entre os pacientes com PV, o alelo DRB1*14:02 foi o mais frequente (o alelo 14 é descrito como de susceptibilidade em população brasileira), juntamente com o DQA1*03:01, descrito como alelo de susceptibilidade na população iraniana e de resistência ao PF na Tunisia (ambos observados em 3/7 pacientes). O HLA DQB1*03:02, associado à apoptose de Treg, confere susceptibilidade para PV e PF, e foi observado em 3 pacientes (1 PF e 2 PV) desse estudo. Dois desses pacientes tiveram Treg quantificadas no sangue periférico (2 PV), e dois, sua função analisada em ensaio de proliferação (1 PF ; 1 PV). Não foram observadas acentuação da redução de Treg no sangue periférico nem diferença na inibição de proliferação pelas mesmas. A análise microscópica da marcação imunohistoquímica para Foxp3 revelou a presença de infiltrado de células imunomarcadas, preferencialmente distribuídas na derme superior, observando-se infiltrado equivalente ao H&E. A distribuição de Foxp3+ foi semelhante nas 6 amostras (4 PF e 2 PV). Já as amostras de biópsia perilesional apresentaram imunomarcação para Foxp3 escassa ou ausente, porém com infiltrado inflamatório observado ao H&E. A microscopia confocal demonstrou dupla marcação CD4+CD25+, confirmando a presença de Treg, já sugerida pela marcação Foxp3+ na histoquímica. Conclusões: As células CD4+CD25high estão diminuídas no PF e no PV. Nos ensaios de proliferação celular, não houve diferença significativa na inibição de proliferação de PBMC pelas células CD25+ de pacientes e controles, sugerindo que a função das Treg esteja preservada nos pênfigos, apesar de reduzidas em número. O alelo HLA DQB1*03:02, presente em 3 pacientes (1 PF e 2 PV), relacionado à apoptose de Treg no diabetes mellitus, não esteve associado à acentuação da redução no número ou função das Treg. Células Foxp3+ encontram-se distribuídas preferencialmente na derme superior nas lesões de pênfigo, com imunomarcação escassa ou ausente nas amostras perilesionais, não correspondendo ao infiltrado inflamatório evidenciado ao H&E. A redução numérica das células Treg no PV e PF pode estar envolvida na fisiopatologia da autoimunidade dessa doença bolhosa.

Introduction: Pemphigus are autoimmune blistering diseases, genetically determined by susceptibility HLA-DR and -DQ. They are characterized by the production of IgG autoantibodies against desmoglein (Dsg) - proteins of the cadherin family, responsible for the adhesion of keratinocytes - and consequent intraepidermal acantholysis. They are classified into two main forms: pemphigus vulgaris (PV) which affects the skin and mucous membranes due to the production of antibodies against Dsg3 and Dsg1, respectively, and pemphigus foliaceus (PF), which exclusively affects the skin by presenting anti-Dsg1 autoantibodies.Five to 10% of CD4+ peripheral blood cells are CD25+, and of these 1% to 2% express increased levels of CD25. These cells have regulatory properties and are called CD4 + CD25high Treg cells. Natural Treg lymphocytes derived from thymus constitutively express CD25, the Foxp3 gene, and surface markers which are not specific, but they assist in their characterization, like CCR4 and CTLA4. The CD4+CD25high T (Treg) cells have the function of inhibiting lymphocyte autoreactive clones, having an important role in immunologic self-tolerance and modulation of immune responses. Regarding pemphigus, it is described an reduction of about ten times the number of Treg cells in the total CD4+ cell count and of the expression of Foxp3 in patients with PV, but not in patients with PF compared to normal controls . Objectives: To verify Treg cells expression in PV and PF. Material and Methods: 15 patients (8 PF ; 7 PV) were included in this study, all of them without immunosuppressive treatment for at least 60 days before the collection of peripheral blood or skin biopsy. Blood samples from 12 patients (6 PF ; 6 PV) and 12 controls matched by age, sex and race, were subjected to quantification and phenotyping of Tregs by flow cytometry, and samples from 10 patients (5 PF; 5 PV ) and 10 matched controls, to the cell proliferation assay and co-culture to investigate the functional properties of Treg. The determination of HLA-DQ and -DR was performed in 13 patients (PF 6, 7 LW). For immunohistochemistry (IHC) studies of and confocal microscopy, it was collected skin biopsies from lesions of 6 patients (4 PV and 2 PF), and perilesional region of 5/6 patients (3 FP, 2 PV). We used the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney analysis for the quantification of immunostained cells, and Friedman and Wilcoxon, for the function of Tregs. We considered statistical significance α = 0.05. Results: In the PV group, the median percentage of CD4+CD25high Treg cells was 1%; the PF group of 1.01%; and 1.57% in controls, with significant differences among the three groups (p = 0.009), the multiple comparison Dunn was significant between PF and controls (p = 0.05), and between PV and controls (p = 0, 02). By grouping patients with PF and PV, compared to controls, the percentage of CD4+CD25high Treg was lower in the pemphigus group (p = 0.0013) as well as CD4+T CD25highFoxp3 + cells and CD4+ CD25highCCR4+ among patients compared to controls (p = 0.001 and p = 0.04, respectively). In proliferation assays, there was no difference in the ability of Treg from patients and controls to inhibit proliferation of PBMC cocultivated. The HLA DRB1*01:02, related to susceptibility to PF in the Brazilian population, was frequent in 3/6 patients with PF in this study. Among patients with PV, DRB1*14:02 was the most frequent allele (*14 gene as described as a susceptibility gene in Brazilian population) together with DQA1*03:01, described as a susceptibility allele in the Iranian population and as resistance to PF in Tunisia (both observed in 3/7 patients). The HLA DQB1*03:02, associated with the apoptosis of Treg confers susceptibility to PV and PF, and was observed in 3 patients (1 PF ; 2 PV) of the study. Two of these patients had Treg quantified in peripheral blood (2 PV), and two, their function analyzed in proliferation assay (1 PF ; 1 PV). Not greater reduction of Treg in the peripheral blood or differences in inhibition of proliferation was observed. Microscopic analysis of immunohistochemical staining for Foxp3 showed the presence of an infiltrate of immunostained cells distributed preferentially in the upper dermis, with equivalent infiltrate in H&E. The Foxp3+ distribution was similar in the 6 samples (4 PV ; 2 PF). However, the samples of perilesional biopsy showed sparse or absent immunostaining for Foxp3, but with inflammatory infiltrate observed by H&E staining. Confocal microscopy showed CD4+CD25+ double labeling, confirming the presence of Treg, as suggested by the labeling histochemistry Foxp3+. Conclusion: Treg CD4+CD25high cells are reduced in PF and PV. In proliferation assays, there was no significant difference in the inhibition of PBMC proliferation by CD25+ cells from patients and controls, suggesting that the function of Treg is preserved in pemphigus, although reduced in number. The HLA DQB1*03:02, associated with apoptosis of Treg, confers susceptibility to PV and PF and was observed in 3 patients in this study, but with no associated reduction in the number or function of Treg among them. Foxp3+ cells are preferably distributed in the upper dermis in pemphigus lesions with little or no immunostaining in perilesional samples, although inflammatory infiltrate evidenced by H&E. The reduced number of Treg cells in PV and PF may be involved in the pathophysiology of this autoimmune bullous disease.