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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-05062020-090755
Documento
Autor
Nome completo
Gabriel Azevedo Públio
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2020
Orientador
Banca examinadora
Alves Filho, José Carlos Farias (Presidente)
Vinolo, Marco Aurelio Ramirez
Souza, Cacilda da Silva
Título em português
O papel da enzima glicolítica piruvato quinase M2 (PKM2) na sinalização via IL-17A em queratinócitos e patogênese da psoríase
Palavras-chave em português
IL-17A
Piruvato quinase M2 (PKM2)
Psoríase
Queratinócitos
Resumo em português
A psoríase é uma doença crônica imunomediada que acomete a pele, caracterizada pela ativação e hiperproliferação de queratinócitos em resposta à citocinas, como IL- 17A. Estudos demonstram que células do sistema imune passam por uma reprogramação metabólica glicolítica (efeito warburg) durante a ativação, a qual é importante para modular as suas funções. Nesse sentido, foi demonstrado que a piruvato quinase M2 (PKM2), uma enzima do metabolismo glicolítico, é essencial para resposta inflamatória em macrófagos e linfócitos, além disso, descrevemos a participação dessa enzima no desenvolvimento da psoríase experimental. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho é investigar os efeitos funcionais e moleculares da PKM2 na ativação de queratinócitos ativados por IL-17A. Primeiramente, observamos um aumento na expressão de PKM2 em uma linhagem de queratinócitos humanos (HaCat) frente a estimulo de IL-17A, visto por qPCR, Western Blot e Imunofluorescência. Em um passo seguinte, utilizamos a tecnologia CRISPR/Cas9 para gerar células HaCat deficientes para PKM2. Frente a ausência dessa enzima observamos uma redução na produção de mediadores inflamatórios como TNF- α e CXCL-1/IL-8 pelas células ativadas por IL-17A, resultando numa menor capacidade de recrutar neutrófilos em um ensaio de quimiotaxia in vitro. Além disso, a ausência de PKM2 nos queratinócitos inibiu a sinalização de NF-kB, avaliado pela translocação a subunidade p65 e pela atividade de NF-kB utilizando Células HaCat-Luc. Mecanisticamente, observamos que a PKM2 está interagindo com as proteínas acessórias ao receptor de IL-17A (IL-17RA), Act1 e TRAF6. Baseado no exposto acima, os resultados desse trabalho ressaltam a importância da PKM2 no desenvolvimento da psoríase, atuando na sinalização de IL-17A em queratinócitos, o que nos permite acreditar que esta molécula seja um potencial alvo terapêutico para tratamento de psoríase.
Título em inglês
The role of the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2 (PKM2) on keratinocytes IL-17A signaling and psoriasis pathogenesis
Palavras-chave em inglês
IL-17A
Keratinocytes
Psoriasis
Pyruvate kinase M2 (PKM2)
Resumo em inglês
Psoriasis is a chronic immunomediated skin disease characterized by a hyperproliferation and activation of keratinocytes in response of cytokines, such as IL- 17A. Recent studies have shown that immune cells undergo a metabolic reprograming known as Warburg effect during activation, this phenomenon is important for their activity. Accordingly, it has been shown that pyruvate kinase M2 (PKM2) a glycolytic enzyme, is essential for macrophages and lymphocytes inflammatory response, also recently our research group described the participation of this enzyme on the development of experimental psoriasis. Therefore, this work aims to investigate the molecular and functional effects of PKM2 during keratinocyte activation. We first observed an increase in PKM2 expression on IL-17A activated human keratinocytes cell line (HaCat). In this context, we utilized the CRISPR/Cas9 technology as a tool to produce PKM2 deficient HaCat cells. In the absence of PKM2 the keratinocytes did not respond to IL-17A stimulation, with a clear reduction on the production of chemokines, such as TNF-α and CXCL-1/IL-18, impacting their capacity to recruit neutrophils in vitro. Beyond that, in the absence of PKM2 there was no NF-kB p65 translocation to the nucleus, seen by the activation of NF-kb reporter HaCat cells. We also demonstrated for the first time the interaction of PKM2 with the proteins Act1 and Traf6, important adaptors proteins in the IL17RA signalling. Taken together, our results show the importance of PKM2 on psoriasis development, acting on Il-17A activated keratinocytes. We conclude that PKM2 is a potential therapeutic target that can be use in the treatment of psoriasis.
 
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Data de Publicação
2020-07-13
 
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