A ativação de neutrófilos desencadeia os processos de fagocitose, metabolismo oxidativo, desgranulação, e formação e liberação de neutrophil extracellular traps (NETs), que atuam em conjunto na eliminação dos agentes infecciosos. Entretanto, em doenças autoimunes como a artrite reumatoide (AR), caracterizada pela deposição de complexos imunes na sinóvia, ocorre um intenso recrutamento e ativação local de neutrófilos, que agrava o quadro clínico da doença. Nesse contexto, a modulação das funções efetoras dos neutrófilos representa uma abordagem promissora para o tratamento adjuvante da AR. Estudos prévios do nosso grupo de pesquisa demonstraram que o derivado 3-fenilcumarínico 6,7-diidroxi-3-[3',4'-metilenodioxifenil]-cumarina (C13), sintetizado com base em metabólitos secundários de origem vegetal, modula negativamente o metabolismo oxidativo de neutrófilos de sangue periférico de indivíduos saudáveis, apresentando valores de CI₅₀ - concentração necessária para inibir 50% da quimioluminescência dependente de luminol (QL1um) - próximos a 1 µM (na forma livre) e 3 µM (incorporada em lipossomas). Em continuidade a essas investigações, na primeira parte deste trabalho foi avaliado o efeito modulador in vitro da C13, livre e/ou lipossomal, sobre a produção de espécies reativas de oxigênio, a desgranulação de elastase, e a formação e liberação de NETs, de neutrófilos de sangue periférico de pacientes com AR, estimulados via receptores Fcγ e/ou receptores do complemento. Na faixa de 1-3 µM, a C13 livre e lipossomal inibiram aproximadamente 50% da QL1um, sem interferir nas demais funções efetoras dos neutrófilos avaliadas. Na concentração de 20 µM, a C13 livre e lipossomal inibiram cerca de 50% da produção de HOC1, 60% da liberação de elastase, e 40% da formação e liberação de NETs. Na segunda parte deste trabalho, foi avaliada a toxicidade da C13 sobre neutrófilos de sangue periférico de pacientes com AR e de indivíduos saudáveis, sob condições de cultura (18 h, 37ºC, 5% de CO2). Em ambos os grupos, a C13 não alterou significativamente a viabilidade dos neutrófilos, que se manteve em torno de 80%, conforme avaliado pelos ensaios de exclusão do corante Azul de Tripan e determinação da atividade da enzima lactato-desidrogenase. Entretanto, a C13 modulou os estágios de morte dos neutrófilos, reduzindo a porcentagem de células apoptóticas e aumentando a porcentagem de células necróticas, analisadas por citometria de fluxo. Em neutrófilos de ambos os grupos, tratados ou não com C13, a porcentagem de células hipodiploides (média = 15%) e o nível de expressão do receptor CD64 permaneceram constantes, independentemente do tempo de cultura, mas o nível de expressão do receptor CD62L decaiu em função do tempo de cultura, conforme avaliado por citometria de fluxo. A análise conjunta dos resultados obtidos indica que o derivado 3-fenilcumarínico C13 pode servir de protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos com possível utilização no tratamento adjuvante de doenças com participação ativa dos neutrófilos, como a AR.

Neutrophil activation triggers the processes of phagocytosis, oxidative metabolism, degranulation, and formation and release of neutrophil extracellular traps (NETs), which act in concert to eliminate the infectious agents. However, in autoimmune diseases like rheumatoid arthritis (RA), characterized by synovial deposition of immune complexes, there is a massive local recruitment and activation of neutrophils, which aggravates the clinical scenario of the disease. ln this sense, modulation of the effector functions of neutrophils represents a promising approach for the adjuvant treatment of RA. Previous studies from our research team have demonstrated that the 3-phenylcoumarin derivative 6,7-dihydroxy-3-[3',4'methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13), which was synthesized based on plant secondary metabolites, negatively modulates the oxidative metabolism of healthy individuals' peripheral blood neutrophils, giving lC₅₀ values - concentration required to inhibit the luminol-enhanced chemiluminescence (CL1um) by 50% - of nearly 1 µM and 3 µM in the free and liposomal forms, respectively. To continue these investigations, in the first part of the present study we examined the in vitro modulating effect of free and/or liposomal C13 on the reactive oxygen species generation, degranulation of elastase, and formation and release of NETs, in RA patients' peripheral blood neutrophils, stimulated via Fcγ and/or complement receptors. At the concentration range of 1-3 µM, free and liposomal C13 suppressed CL1um by approximately 50%, without interfering in the other neutrophil effector functions here investigated. At 20 µM, free and liposomal C13 inhibited nearly 50% of HOC1 production, 60% of elastase release, and 40% of the NETs formation and release. ln the second part of this study, we examined the toxicity of C13 towards peripheral blood neutrophils from RA patients and healthy individuals, under culture conditions (18 h, 37ºC, 5% CO2). ln both groups, C13 did not significantly altered the neutrophil viability, which remained about 80%, as assessed by the Trypan Blue exclusion test and determination of lactate dehydrogenase activity. However, C13 modulated the neutrophil death stages - it lowered the percentage of apoptotic cells and increased the percentage of necrotic cells - as analyzed by flow cytometry. ln neutrophils from both groups, treated or not with C13, the percentage of hypodiploid cells (mean = 15%) and the level of CD64 receptor expression remained constant regardless of the culture time, but the level of CD62L receptor expression decreased with culture time, as assessed by flow cytometry. Together, our results indicate that the 3-phenylcoumarin derivative C13 can be used as a prototype for the development of novel drugs with possible application in the adjuvant treatment of diseases in which neutrophils actively participate, such as RA.