O Diabetes mellitus tipo 1 é caracterizado pela destruição de células beta produtoras de insulina, resultando em hiperglicemia. Novas estratégias terapêuticas são importantes para controlar a doença e impedir/amenizar as complicações associadas. Nos últimos anos, o uso de probióticos naturais ou recombinantes tem mostrado efeitos benéficos em doenças autoimunes, principalmente pela modulação da microbiota intestinal, indução de tolerância ou mecanismos de imunorregulação. Já foi mostrado que a proteína do choque térmico 65 (HSP65), uma chaperona molecular que mantém a estrutura e função das proteínas, possui atividade anti-inflamatória em doenças autoimunes e inflamatórias crônicas. Nesse sentido, o objetivo no trabalho foi avaliar o efeito profilático-terapêutico de Lactococcus lactis expressando HSP65 durante o desenvolvimento de DM1 em modelo experimental. Primeiro, observamos que a HSP65 recombinante induz a diferenciação de dois subtipos de células dendríticas convencionais in vitro, cDC1 e cDC2, com perfis de ativação distintos. As células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) estimuladas com rHSP65 produziram mais IL-10 em comparação com aquelas estimuladas com LPS. Além disso, as BMDCs CD103+ estimuladas com rHSP65 co-cultivadas com células T CD4+ virgens induziram diferenciação de células T reguladoras (Tregs). Posteriormente, utilizamos um modelo profilático-terapêutico envolvendo a administração de L. lactis expressando HSP65 em camundongos com DM1 induzida por estreptozotocina (STZ) e em camundongos diabéticos não obesos (NOD), que desenvolvem DM1 espontânea. Em ambos os modelos, observamos que a administração de L. lactis-HSP65 reduziu a hiperglicemia e a incidência da doença. No modelo de indução com STZ, observamos aumento na expressão de insulina nas ilhotas pancreáticas e diminuição dos níveis séricos de IgG anti-HSP65 em comparação com camundongos diabéticos que não receberam probiótico. Além disso, L. lactis aumentou a expressão de genes associados à função de barreira intestinal no cólon, tais como Reg3g e Tjp1. Observamos um aumento nas populações de cDC1 TLR2+ e Tregs PD-1 + no linfonodo cecal (LC) e Tregs LAP+ nos linfonodos pancreáticos (LP), associado ao aumento de IL-10 e TGF-β no pâncreas de camundongos que receberam L. lactis-HSP65. Por outro lado, a administração de L. lactis-HSP65 em camundongos deficientes de TLR2 não foi capaz de reduzir a incidência da doença e controlar a hiperglicemia como observado nos camundongos selvagens. Esses dados foram associados com menores porcentagens de cDC1 e Tregs e redução na produção de IL-10 no pâncreas. Nas BMDCs, observamos que o TLR2 é fundamental para a expressão gênica de Irf8 e Il-10, e também para a geração de cDC1 e produção de IL-10. Finalmente, observamos que BMDCs CD103+ deficientes de TLR2 ou IL-10 estimuladas com rHSP65 e co-cultivadas com células T CD4+ virgens induziram menor porcentagem de Tregs quando comparado às BMDCs de camundongos selvagens. Em resumo, os resultados demonstram que L. lactis-HSP65 induziu proteção contra o DM1 através da imunorregulação mediada por linfócitos T reguladores e células dendríticas tolerogênicas por meio de um mecanismo dependente de TLR2/IL-10.

Type 1 Diabetes mellitus is characterized by the destruction of insulin-producing beta cells, resulting in hyperglycemia. New therapeutic strategies are important to control the disease and prevent/mitigate associated complications. In recent years, the use of natural or recombinant probiotics has shown beneficial effects in autoimmune diseases, mainly by modulating the intestinal microbiota, inducing tolerance or immunoregulatory mechanisms. It has been shown that heat shock protein 65 (HSP65), a molecular chaperone that maintains the structure and function of proteins, has anti-inflammatory activity in autoimmune and chronic inflammatory diseases. In this sense, the objective of the work was to evaluate the prophylactic-therapeutic effect of Lactococcus lactis expressing HSP65 during the development of DM1 in an experimental model. First, we observed that recombinant HSP65 induces the differentiation of two subtypes of conventional dendritic cells in vitro, cDC1 and cDC2, with distinct activation profiles. Bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) stimulated with rHSP65 produced more IL-10 compared to those stimulated with LPS. Furthermore, rHSP65-stimulated CD103+ BMDCs co-cultured with naïve CD4+ T cells induced differentiation of regulatory T cells (Tregs). Subsequently, we used a prophylactic-therapeutic model involving the administration of L. lactis expressing HSP65 in mice with streptozotocin (STZ)-induced DM1 and in non-obese diabetic mice (NOD), which develop spontaneous DM1. In both models, we observed that administration of L. lactis-HSP65 reduced hyperglycemia and disease incidence. In the STZ induction model, we observed an increase in insulin expression in pancreatic islets and a decrease in serum levels of IgG anti-HSP65 compared to diabetic mice that did not receive probiotics. Furthermore, L. lactis increased the expression of genes associated with intestinal barrier function in the colon, such as Reg3g and Tjp1. We observed an increase in the populations of cDC1 TLR2+ and PD-1 + Tregs in the cecal lymph node (LC) and LAP+ Tregs in the pancreatic lymph nodes (LP), associated with increased IL-10 and TGF-β in the pancreas of mice that received L. lactis-HSP65. On the other hand, the administration of L. lactis-HSP65 in TLR2-deficient mice was not able to reduce the incidence of the disease and control hyperglycemia as observed in wild-type mice. These data were associated with lower percentages of cDC1 and Tregs and reduced IL-10 production in the pancreas. In BMDCs, we observed that TLR2 is essential for the gene expression of Irf8 and Il-10, and also for the generation of cDC1 and IL-10 production. Finally, we observed that TLR2- or IL-10-deficient CD103+ BMDCs stimulated with rHSP65 and co-cultured with naïve CD4+ T cells induced a lower percentage of Tregs when compared to BMDCs from wild-type mice. In summary, the results demonstrate that L. lactis-HSP65 induced protection against T1D through immunoregulation mediated by regulatory T lymphocytes and tolerogenic dendritic cells through a TLR2/IL-10-dependent mechanism.