A terapia alogênica com células T expressando receptores quiméricos de antígeno (CARs) é uma estratégia promissora para aumentar a acessibilidade ao tratamento. Essa abordagem possui inúmeras vantagens, como a disponibilidade de um produto pronto para o uso, padronizado e com custo reduzido devido ao escalonamento da produção. No entanto, a implementação desta abordagem em larga escala suscita preocupação pelo desenvolvimento da doença do enxerto contra o hospedeiro, uma complicação potencialmente fatal causada pelo reconhecimento de aloantígenos pelo receptor de células T (TCR) dos linfócitos T-CAR. Uma solução para contornar este obstáculo é a depleção do TCR da superfície das células T-CAR por meio de ferramentas de edição gênica. Neste trabalho, foi descrito o processo de estabelecimento de uma plataforma de produção de células T-CAR anti-CD19 alogênicas baseada na depleção do TCR por nocaute ou inserção gênica direcionada utilizando CRISPR/Cas9. Primeiramente, avaliou-se a eficiência de dois RNAs guia (gRNAs) na depleção do TCR, tendo como alvo o gene codificante da região constante da cadeia α do TCR (TRAC). Foi utilizado um modelo de células T eletroporado com o plasmídeo codificante da Cas9 e identificado um gRNA capaz de gerar até 80% de células CD3-, sendo este escolhido para as etapas subsequentes. Para a estratégia de produção por nocaute gênico, células T foram transduzidas com partículas lentivirais para a expressão do CAR e eletroporadas para a entrega dos complexos riboucleoproteicos (RNPs) de Cas9 e gRNA. Foi observada uma maior eficiência de edição e recuperação celular quando a ativação celular precedeu a eletroporação. A eficiência de nocaute foi superior a 86%, sendo que ~39% das células apresentaram o fenótipo de interesse (CAR+CD3-). A viabilidade celular alcançou 75% após dois dias da transdução e permaneceu acima de 60% após a eletroporação. Comparadas às células T-CAR convencionais, as editadas mantiveram a citotoxicidade seletiva ao antígeno CD19 e apresentaram níveis aumentados de secreção de interferon-γ. Em seguida, redirecionamos a ferramenta CRISPR/Cas9 para a inserção dirigida (knock-in) do CAR e o nocaute do TCR em uma estratégia de etapa única, eliminando a necessidade do uso de vetores virais. O knock-in no locus TRAC foi feito através do fornecimento de um template de DNA de fita dupla, que foi entregue em conjunto com as RNPs via eletroporação, para direcionar o reparo por homologia. Observamos porcentagens elevadas de nocaute do TCR (~91,5%) e de knock-in do CAR (~83,7%) 5 dias após a eletroporação. O crescimento celular moderado foi um reflexo da queda na viabilidade, a qual correspondeu a 27% no dia 3 e ~60% no dia 7 de manufatura. Embora tenhamos confirmado a integração do transgene CAR no alvo por ensaio de PCR "in-out", observamos uma queda na frequência de células CAR+ em tempos de cultura prolongados. Apesar disso, nesse estágio, as células T-CAR editadas apresentaram atividade contra células tumorais alvo. Ainda que promissor, este protocolo requer otimizações. Por outro lado, a produção de células T-CAR editadas por nocaute gênico se mostrou uma metodologia robusta, permitindo a obtenção de uma elevada eficiência de edição e um rendimento celular satisfatório.

Allogeneic chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy represents a promising strategy to increase treatment accessibility. This approach has numerous advantages, such as the availability of an off-the-shelf, standardized product at a reduced cost due to production scaling. However, the large-scale implementation of this approach raises concerns for the graft-versus-host disease development, a potentially fatal complication caused by antigen recognition by the T cell receptor (TCR) on CAR T cells. A solution to overcome this challenge is the TCR deletion from CAR T cell surface using gene editing tools. This work described the establishment process of a platform for allogeneic anti-CD19 CAR T-cell production based on TCR depletion by gene knockout or targeted insertion using CRISPR/Cas9. First, the efficiency of two guide RNAs (gRNAs) in depleting the TCR was evaluated by targeting the TCR alpha-chain constant region (TRAC) gene. A T cell model was electroporated with the Cas9-encoding plasmid and a gRNA capable of generating up to 80% of CD3- cells was selected for the subsequent steps. For the gene knockout strategy, T cells were transduced with lentiviral particles for CAR expression and electroporated for delivering Cas9-gRNA ribonucleoprotein complexes (RNPs). Higher cell editing efficiency and recovery were observed when cell activation preceded the electroporation. Knockout efficiency was greater than 86%, with ~39% of the cells showing the phenotype of interest (CAR+CD3-). Cell viability reached 75% two days after transduction and remained above 60% after electroporation. Compared to conventional CAR T-cells, the edited ones maintained selective cytotoxicity to the CD19 antigen and showed increased levels of interferon-γ secretion. We then repurposed the CRISPR/Cas9 tool for targeted CAR knock-in and TCR knockout in a single-step approach, eliminating the need for viral vectors. Knock-in at the TRAC locus was performed by providing a double-stranded DNA template, co-delivered with the RNPs via electroporation, to direct the homology repair. We observed high percentages of TCR knockout (~91.5%) and CAR knock-in (~83.7%) 5 days post-electroporation. The moderate cell growth reflected the viability drop, reaching 27% of viable cells on day 3 and ~60% on day 7 of manufacturing. Although we did confirm the integration of the CAR transgene into the TRAC locus using an "in-out" PCR assay, we observed a drop in the frequency of CAR+ cells at prolonged culture times. Nevertheless, at this stage, edited CAR T cells exhibited activity against target tumor cells. Despite its potential, the knock-in approach requires refinements. On the other hand, the production of edited CAR T cells through gene knockout has proven to be a robust methodology, allowing for high editing efficiency and satisfactory cell yield.