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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.23.2016.tde-04112016-110527
Document
Author
Full name
Victor Haruo Matsubara
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2016
Supervisor
Committee
Mayer, Marcia Pinto Alves (President)
Ito, Cristiane Yumi Koga
Nakamae, Atlas Edson Moleros
Silva, Wander José da
Sugaya, Norberto Nobuo
Title in Portuguese
Efeito de bactérias probióticas sobre Candida albicans: ensaios em cultura de macrófagos e de biofilme
Keywords in Portuguese
Biofilme
Candida albicans
Lactobacillus
Macrófagos
Probióticos
Abstract in Portuguese
Apesar das evidências sobre o efeito de bactérias probióticas sobre Candida albicans, os mecanismos envolvidos nesta interação não estão totalmente esclarecidos. Visando contribuir com o entendimento sobre os mecanismos pelos quais bactérias probióticas interferem na colonização por C. albicans, o presente estudo testou a hipótese de que Lactobacillus probióticos interferem na resposta de macrófagos humanos induzida por C. albicans e inibem o desenvolvimento do biofilme de C. albicans. Macrófagos humanos THP-1 foram pré-tratados com Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m e Lactobacillus acidophilus NCFM, e desafiados com C. albicans e/ou lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli, em ensaio de co-cultura. Após incubação, foram determinados o perfil de citocinas por ELISA, a transcrição relativa do gene clec7a por RT-qPCR. Biofilmes de C. albicans ATCC SC5314 e 75 (isolado clínico) em fase de adesão inicial, colonização inicial e maturação foram tratados com suspensão de Lactobacillus probióticos. Além disso, os biofilmes de C. albicans foram tratados com meio condicionado com L. rhamnosus após diferentes períodos experimentais. O efeito dos probióticos foi avaliado por contagem de células de C. albicans viáveis e avaliação da morfologia celular por microscopia confocal e eletrônica de varredura. O pré-tratamento com bactérias probióticas promoveu alteração no perfil de citocinas produzidas por macrófagos desafiados com LPS e C. albicans, induzindo um aumento nos níveis de IL-10 e redução de IL-12 (p<0,05). Além disso, o pré-tratamento com probióticos provocou redução do nível de transcritos de clec7a, que codifica o receptor Dectina-1 (p<0,05), indicando a redução da expressão de Dectina-1 nestas células. A interação entre cepas de Lactobacillus e C. albicans promoveu significativa redução (p<0,05) no número de células de C. albicans no biofilme (25,5-61,8%), na dependência da cepa probiótica e da fase do biofilme de C. albicans. Todos os Lactobacillus testados impactaram negativamente na diferenciação levedura-hifa de C. albicans e na formação do biofilme. Análises microscópicas revelaram que as suspensões de L. rhamnosus reduziram a diferenciação de Candida em hifas, levando a uma predominância de crescimento em levedura. O meio condicionado com L. rhamnosus não exerceu efeito significante sobre biofilme maduro (p>0,05), mas promoveu redução significativa do número de UFC de C. albicans quando utilizado nos estágios iniciais da formação do biofilme (p<0,01). Os resultados sugerem que Lactobacillus probióticos são capazes de interferir na expressão de receptores de macrófagos para o reconhecimento de C. albicans e reduzir a resposta de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, os resultados indicam que Lactobacillus probióticos são capazes de inibir a diferenciação de C. albicans de leveduras para hifas, e o desenvolvimento de biofilme de C. albicans, particularmente na fase de colonização inicial da levedura, por interações célula-célula e secreção de exometabólitos. O conjunto de dados deste estudo contribui para elucidar os mecanismos pelos quais Lactobacillus atuam como probióticos, dando suporte para o seu uso como terapia suplementar contra infecções de mucosas por C. albicans.
Title in English
Effect of probiotic bacteria against Candida albicans: macrophages cell culture and biofilm assays
Keywords in English
Biofilm
Candida albicans
Lactobacillus
Macrophages
Probiotics
Abstract in English
The infection rates of Candida albicans in human may be reduced by probiotics. However, the mechanisms involved in the interaction between C. albicans and probiotic bacteria are largely unknown. The present study comprised two parts. The first aimed to test the hypothesis that probiotics may impair the signaling induced by C. albicans in human macrophages, thus lowering the inflammatory challenge. The second aimed to evaluate the inhibitory effects of Lactobacillus on different phases of C. albicans biofilm development. In the first part, macrophages were pretreated with a probiotic strain (Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m and Lactobacillus acidophilus NCFM) and challenged with C. albicans and/or lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli in a co-culture assay. After incubation, cytokine profile of macrophage's supernatant was assessed by ELISA and the expression of clec7a gene was determined by RT-qPCR. Probiotic strains altered the cytokine profile of macrophages stimulated with LPS and C. albicans, leading to increased levels of IL-10 and reduced levels of IL-12 (p<0.05), and reducing the relative expression of clec7a gene encoding Dectin-1 receptor (p < 0.05). In the second part, quantification of biofilm growth and microscopic analyses were performed on C. albicans biofilms treated with Lactobacillus cell suspensions and their supernatants. Lactobacilli induced a significant reduction (p<0,05) in the number of biofilm cells (25.5-61.8%) dependent on the probiotic strain and the biofilm phase. L. rhamnosus supernatants had no significant effect on the mature biofilm (p>0.05), but significantly reduced the early stages of Candida biofilm formation (p<0.01). Microscopic analyses revealed that L. rhamnosus suspensions reduced Candida hyphal differentiation, leading to a predominance of budding growth. All lactobacilli negatively impacted C. albicans yeast-to-hyphae differentiation and biofilm formation. The inhibitory effects of Lactobacillus on C. albicans involved both cell-cell interactions and secretion of exometabolites. To conclude, the probiotic lactobacilli reduce inflammation by impairing the recognition of C. albicans by macrophages and altering the production of proinflammatory cytokines. It was also clarified, for the first time, the mechanics of how the Lactobacillus species antagonize C. albicans colonization, particularly in the critical, early colonization phase of the yeast. Taken all together, our data elucidated the inhibitory mechanisms of lactobacilli that define their probiotic candicidal activity, supporting the use of these probiotics as a supplemental therapy against mucosal infections by C. albicans.
 
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Publishing Date
2016-11-21
 
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