Doctoral Thesis

Pessoas que vivem com HIV (PLWH) em terapia antirretroviral combinada (TARVc) apresentam alterações na microbiota relacionadas ao estado imunológico, regime de TARVc e a doenças periodontais. Estas alterações podem induzir inflamação local e sistêmica. Este estudo teve como objetivo analisar a composição da microbiota oral em PLWH sob TARVc com (n= 24) ou sem (n= 25) periodontite usando análise de sequência metagenômica shotgun, para descrever a interação entre espécies bacterianas, parâmetros clínicos e imunológicos e a resposta à terapia periodontal não cirúrgica (TPNS), e avaliar o tecido gengival como um potencial reservatório do HIV-1 (CAAE: 81355517.1.0000.5419). Amostras de saliva, sangue, fluido gengival crevicular, urina e tecido gengival foram coletadas no início do estudo para ambos os grupos, e 30 dias após a TPNS no grupo periodontite. O número de cópias de DNA do HIV foi avaliado por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real, no tecido gengival e em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), adicionalmente, foi avaliada a expressão da proteína viral p24 no tecido através de imunohistoquímica. Os dados demográficos e clínicos foram analisados utilizando estatística descritiva; as variáveis categóricas foram apresentadas como frequência absoluta e porcentual, e as variáveis contínuas como média ± desvio padrão ou mediana, com a normalidade testada pelo teste Shapiro-Wilk. Os grupos foram comparados utilizando os testes exato de Fisher, teste t ou Mann-Whitney, teste de Wilcoxon para comparações múltiplas e heatmap de correlação de Spearman, com significância definida em p < 0,05. Na análise metagenômica, as sequências foram processadas na plataforma Galaxy Europe e as análises subsequentes realizadas em R. No grupo periodontite, todos os parâmetros periodontais apresentaram melhora significativa após TPNS quando comparados ao baseline. A microbiota oral não diferiu significativamente entre pacientes com periodontite e controles. Contudo, uma gama mais ampla de espécies bacterianas foi encontrada na microbiota do grupo periodontite em comparação ao grupo controle, enquanto o grupo periodontite após TPNS apresentou uma diversidade alfa intermediária entre os outros dois grupos. Em relação à distribuição das diferentes espécies bacterianas, observou-se que Porphyromonas gingivalis estava significativamente enriquecida no grupo periodontite, juntamente com diferentes espécies de Treponema sp., Fretibacterium fastidiosum, Campylobacter rectus, Bacteroides zoogleoformans, Tannerella forsythia e Porphyromonas endodontalis. Correlações entre sete marcadores inflamatórios e sete táxons bacterianos relacionados à periodontite foram encontradas na saliva do grupo periodontite, o que não ocorreu no grupo controle; perfis intermediários foram obtidos após TPNS. Em contraste com a saliva, no plasma sanguíneo, não foram observadas diferencias significativas nos marcadores inflamatórios entre os grupos, com exceção do TNF- e, parcialmente IL-4. A detecção de DNA proviral do HIV-1 em PBMCs confirma o reservatório latente sistêmico persistente apesar da TARVc, enquanto a baixa detecção tecidual provavelmente reflete a degradação do ácido nucleico. Uma vez que o desequilíbrio na composição da microbiota oral pode contribuir não apenas para a doença local, mas também para a ativação imune sistêmica no curso da infecção pelo HIV-1, a importância da manutenção da saúde periodontal deve ser reforçada no manejo abrangente de PLWH.

People living with HIV (PLWH) under combined antiretroviral therapy (cART) experience microbiota shifts linked to immune status, ART regimen and periodontal diseases. These shifts are capable of inducing local and systemic inflammation. This study aimed to analyze the composition of the oral microbial community in PLWH under cART with (n=24) or without (n=25) periodontitis using shotgun metagenomic sequence analysis, to describe the interaction between bacterial species, clinical and immunological parameters and the response to non-surgical periodontal therapy (NSPT), and to evaluate gingival tissue as a potential reservoir of HIV-1 (ethics committee approval CAAE: 81355517.1.0000.5419). Saliva, gingival crevicular fluid, gingival tissue, blood and urine samples were collected at baseline from both groups, and 30 days after NSPT from the periodontitis group. The number of copies of HIV DNA was evaluated, by real-time polymerase chain reaction (PCR), in gingival tissue and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), additionally, p24 viral protein expression in gingival tissue was assessed through immunohistochemistry. Demographic and clinical data were analyzed using descriptive statistics; categorical variables were reported as absolute frequency and percentage and continuous variables as mean ± SD or median, with normality tested by the Shapiro-Wilk. Groups were compared using Fishers exact, t test or Mann-Whitney test, Wilcoxon test for multiple comparisons, and Spearman correlation heatmaps, with significance set at p < 0.05. For metagenomic analysis, reads were processed on the Galaxy Europe platform and downstream analyses were performed in R. In the periodontitis group, all periodontal parameters showed highly significant improvement after NSPT when compared to baseline. The oral microbiota did not differ significantly between patients with periodontitis and controls; however, a broader range of bacterial species was found in the microbiota of the periodontitis group compared to the control group, while post-treatment the periodontitis group exhibited intermediate alpha diversity intermediate between the two other groups. Regarding the distribution of the different bacterial species, Porphyromonas gingivalis was found to be significantly enriched in the periodontitis group, along with different Treponema sp., Fretibacterium fastidiosum, Campylobacter rectus, Bacteroides zoogleoformans, Tannerella forsythia and Porphyromonas endodontalis. Correlations between seven inflammatory markers and seven periodontitis-related bacterial taxa were found in saliva of periodontitis patients, which was not the case in controls; interestingly, intermediate profiles were obtained after NSPT. In contrast to saliva, in blood plasma, no marked differences in inflammatory markers were observed between periodontitis and control patients, except for TNF- and partly IL-4. The detection of HIV-1 total DNA in PBMCs confirms the systemic latent reservoir that persists despite cART, while low tissue detection likely reflects nucleic acid degradation or scarce intact provirus. Since an imbalance in oral microbial composition may contribute not only to local disease but also to systemic immune activation during the course of HIV-1 infection, the importance of maintaining periodontal health should be reinforced in the comprehensive management of PLWH.