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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.3.2013.tde-21102014-092645
Document
Author
Full name
Rafael Ferraz Alves
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2013
Supervisor
Committee
Azzoni, Adriano Rodrigues (President)
Astray, Renato Mancini
Gonçalves, Viviane Maimoni
Title in Portuguese
Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega gênica baseados em proteínas e lipossomas.
Keywords in Portuguese
Entrega gênica
Lipossomas
Proteínas recombinantes
Terapia gênica
Vetores não virais
Abstract in Portuguese
Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula.
Title in English
Development and characterization of non-viral vectors based in proteins and liposomes to gene delivery.
Keywords in English
Gene delivery
Gene therapy
Liposomes
Nonviral vectors
Recombinant proteins
Abstract in English
One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.
 
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F_Catal.docx (21.05 Kbytes)
Publishing Date
2014-10-22
 
WARNING: The material described below relates to works resulting from this thesis or dissertation. The contents of these works are the author's responsibility.
  • FAVARO, M.T.P., et al. Development of a non-viral gene delivery vector based on the dynein light chain Rp3 and the TAT peptide [doi:10.1016/j.jbiotec.2014.01.001]. Journal of Biotechnology [online], 2014, vol. 173, p. 10-18.
  • Toledo, M. A. S., et al. Characterization of the human Dynein light chain Rp3 and its use as a non-viral gene delivery vector [doi:10.1007/s00253-013-5239-5]. Applied Microbiology and Biotechnology [online], 2014, vol. 98, p. 3591-3602.
  • Alves, R. F., et al. Desenvolvimento e Caracterização de Vírus Artificiais para a Entrega de DNA em Estudos de Terapia e Vacinação Gênicas. In V Simpósio Latinoamericano de Tecnologia de Cultivos Celulares (V SLATCC), Santa Fé, Argentina, 2012. Anais do V Simpósio Latinoamericano de Tecnologia de Cultivos Celulares., 2012. Resumo.
  • Alves, R. F., et al. Desenvolvimento e Caracterização de Vírus Artificiais para Entrega de DNA em Estudos de Terapia e Vacinação Gênicas. In XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos e X Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassa, Foz do Iguaçú, 2013. Anais do XIX Sinaferm., 2013.
  • Favaro, M. T. P., et al. Development of Non-Viral Gene Delivery Particles Based on the Dynein Light Chain Rp3. In 15th Annual Meeting of the Americam Society of Gene and Cell Therapy, Filadélfia, 2012. Molecular Therapy. : Nature Publishing Group, 2012. Abstract.
  • Favaro, M. T. P., et al. Engineered dynein light chain Rp3: a strategy to exploit cell´s machinery for an enhanced intracellular trafficking of transgenes. In European Society Gene and Cell Therapy - Collaborative Congress 2013, Madri, 2013. Human Gene Therapy. : Mary Ann Liebaert, Inc., 2013. Abstract.
  • TOLEDO, M.A.S., et al. Expressão, Purificação, e Análise Funcional do Peptídeo de Transposição de Membranas TAT. In XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos e X Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassa, Foz do Iguaçú, 2013. Anais do XIX Sinaferm., 2013.
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