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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.41.2020.tde-20012020-102914
Documento
Autor
Nombre completo
Juliana Sobral de Barros
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Krepischi, Ana Cristina Victorino (Presidente)
Costa, Cecilia Maria Lima da
Melaragno, Maria Isabel de Souza Aranha
Morgante, Angela Maria Vianna
Título en portugués
Alterações de número de cópias genômicas em hepatoblastomas: microarranjos genômicos e sequenciamento de nova geração
Palabras clave en portugués
CNA
Copy number alteration
Exoma
Hepatoblastoma
Microarranjo genômico
NGS
Sequenciamento de nova geração
Tumor embrionário
Resumen en portugués
O hepatoblastoma (HB) é um tumor embrionário muito raro, contudo é o tumor hepático mais comum em crianças. Os genomas dos HBs contêm poucas alterações genéticas, sendo caracterizados principalmente pela ocorrência de aneuploidias recorrentes de ganho de cromossomos e/ou braços cromossômicos inteiros; porém, a contribuição dessas alterações para a gênese do HB ainda é pouco compreendida. Alterações de número de cópias genômicas (CNAs) segmentares foram também descritas nestes tumores, restritas a regiões específicas de alguns cromossomos, algumas delas em associação a características clínicas como progressão e pior prognóstico. O principal objetivo deste estudo foi caracterizar o padrão de CNAs em 25 HBs por análise citogenômica utilizando microarranjos genômicos, metodologia considerada padrão-ouro para detecção de CNAs submicroscópicas (< 4 Mb). Com os resultados obtidos pela técnica de hibridação genômica comparativa em microarranjos, os 25 tumores analisados foram separados em três categorias de acordo com seu perfil genômico: sete HBs não apresentaram alteração detectável, treze apresentaram poucas CNAs (até quatro alterações cromossômicas e/ou alterações focais) e cinco tumores apresentaram genomas com muitas CNAs, considerados complexos. Cento e vinte três CNAs foram detectadas no grupo de tumores, sendo que as CNAs mais prevalentes no grupo de HBs foram ganhos em 1q, 2/2q e 20/20p, e perdas em 1p/1pter e 4/4q. Além disso, foi possível delimitar seis regiões cromossômicas mais comumente afetadas por CNAs na coorte (minimum common region - MCRs) ganhos em 1q31.3q42.3, 2q24.2q24.3, 20p13p11.1 e perdas em 1p36.31, 4p14, 4q21.22q25. Dentro de tais regiões, a avaliação em bancos de dados indicou 17 genes (CHD5, BLACAT1, KDM5B, PARP1, LINC00210, MDM4, CHI3L1, PCAT6, PROX1, UBE2T, DPP4, FAP, HPSE, LEF1, NFKB1, PTPN13 e JAG1) como potencialmente relacionados à tumorigênese e/ou progressão em HB, sendo candidatos para estudos futuros de expressão gênica. Dentre tais genes, apenas dois foram previamente relacionados a HB, ambos localizados na MCR de ganho 1q31.3q42.3: MDM4 e PARP1. Na coorte estudada, 11 tumores apresentaram essa MCR de ganho 1q31.3q42.3; ao analisar a estratificação de risco de tais pacientes, 10/11 eram de risco alto (6) ou intermediário (4), sendo que quatro foram a óbito. Tendo em vista o número elevado de pacientes de risco alto/intermediário nesse subgrupo de tumores, ganho de 1q31.3q42.3 pode estar associado a tumores mais agressivos. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar o desempenho de três plataformas diferentes de sequenciamento de nova geração (NGS), exoma completo, painel OneSeq e painel TruSight One, em relação à técnica padrão-ouro para detecção de CNAs (microarranjo genômico). Nossos resultados de 19 HBs sequenciados mostraram alta concordância entre os dados de aCGH e NGS (~87%); a grande maioria dos casos discordantes (CNAs detectadas apenas por aCGH ou NGS) foram regiões sem cobertura em uma das plataformas. O tamanho mínimo de CNA detectada nos dados de NGS foi de 109 Kb em uma amostra sequenciada em exoma completo, não detectada por aCGH por falta de cobertura. Verificamos também que é possível em dados de NGS detectar CNAs em mosaico (frequência mínima do mosaico de ~10% para perdas e ~20% para ganhos) e regiões em homozigose ou cnLOH (copy-neutral losses of heterozygosity). Contudo, existem certas limitações inerentes aos dados de NGS produzidos com captura de regiões genômicas (exoma e painéis), como a falta de uniformidade de cobertura horizontal e distribuição irregular de exons pelo genoma, que dificultam a detecção do espectro total de CNAs e delimitação de pontos de quebra. Além disso, foi possível constatar que a profundidade do sequenciamento é um fator preponderante para a qualidade dos dados de CNAs obtidos a partir de NGS, uma vez que regiões com baixa profundidade de cobertura tem detecção ou delimitação de tamanho prejudicadas. Apesar de tais limitações, o grande potencial para obtenção de resultados acurados referentes a mutações e CNAs já possibilita a substituição dos microarranjos genômicos pelas plataformas de NGS como primeira linha de investigação genômica
Título en inglés
Chromosomal copy number changes in hepatoblastomas: genomic microarrays and next generation sequencing
Palabras clave en inglés
CNA
Copy number alteration
Embryonic tumor
Exome
Genomic microarray
Hepatoblastoma
Next generation sequencing
NGS
Resumen en inglés
Hepatoblastoma (HB) is a very rare embryonic tumor, although it is the most common liver tumor in children. HBs genomes contain few genetic alterations, being mainly characterized by recurrent aneuploidy gains of whole chromosome and / or whole chromosomal arms; However, the contribution of these changes to the genesis of HB is still poorly understood. Segmental genomic copy number alterations (CNAs) have also been described in these tumors, restricted to specific regions of some chromosomes, some of them in association with clinical features such as progression and poor prognosis. The main aim of this study was characterizing the CNA pattern of 25 HBs by cytogenomic analysis using genomic microarrays (chromosomal microarray analysis - CMA), considered the gold standard methodology for detection of submicroscopic CNAs (<4 Mb). Based on the results obtained by CMA, the 25 tumors could be classified in three categories according to their genomic profile: seven HBs showed no detectable alteration, thirteen presented few CNAs (up to four chromosomal alterations and/or focal alterations) and five tumors carried many CNAs, with complex genomes. One hundred and twenty-three CNAs were detected in the tumor group, and the most prevalent CNAs in the HBs group were gains at 1q, 2 / 2q and 20 / 20p, and losses at 1p / 1pter and 4 / 4q. In addition, it was possible to delimitate six chromosomal regions most commonly affected by CNAs in the cohort (minimum common regions - MCRs), located at: 1q31.3q42.3, 2q24.2q24.3, 20p13p11.1 (gains) and 1p36.31, 4p14, 4q21.22q25 (losses). In silico evaluation of the regions indicated 17 genes ((CHD5, BLACAT1, KDM5B, PARP1, LINC00210, MDM4, CHI3L1, PCAT6, PROX1, UBE2T, DPP4, FAP, HPSE, LEF1, NFKB1, PTPN13 and JAG1) as potentially related to tumorigenesis and/or HB progression, being candidates for future gene expression studies. Among these genes, only two were previously related to HB, both mapped to the MCR 1q31.3q42.3 gain: MDM4 and PARP1. In the cohort, 11 tumors presented this MCR 1q31.3q42.3 gain, and considering clinical data, ten of them were either high risk (6) or intermediate risk (4), with four deceased patients. Given the number of high/intermediate risk patients in this subgroup of tumors, 1q31.3q42.3 gain may be associated with more aggressive tumors. The second aim of this work was comparing the performance of three different next generation sequencing platforms (NGS), whole exome sequencing, OneSeq panel and TruSight One panel, with the gold-standard technique for detection of CNAs (CMA). Our results, based on data from 19 HBs, showed high rate of concordance between CMA and NGS data (~87%); the vast majority of the discordant cases (CNAs detected only by aCGH or NGS) were regions without coverage in one of the platforms. The minimum size of CNA detected in the NGS data was 109 Kb, not detected by CMA due to lack of coverage. We also found that it is possible to detect mosaic CNAs in NGS data (minimum mosaic frequency of ~10% for losses and ~20% for gains), as well as homozygous regions or cnLOH (copy-neutral losses of heterozygosity). However, there are limitations using NGS data based on capture (exome and panels), which can impair the detection of the full CNA spectrum and precise size mapping. Moreover, it was found that sequencing depth is a major issue for CNA detection using NGS data, since regions with low depth coverage have impaired detection or size delimitation. Despite these limitations, the great potential for obtaining accurate results both for mutations and CNAs allows the replacement of CMA by NGS platforms as the first line of genomic research
 
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Fecha de Liberación
2022-01-19
Fecha de Publicación
2020-02-20
 
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