O complexo da esclerose tuberosa (TSC, do inglês, tuberous sclerosis complex) é uma doença sistêmica, caracterizada por tumores benignos em diferentes órgãos e causada por variantes patogênicas nos genes supressores de tumores TSC1 ou TSC2. As proteínas TSC1 e TSC2 inibem a via de mTORC1, central no controle do crescimento e proliferação celular. A atividade de mTORC1 tem sido relacionada à expressão diferencial de determinados genes. Contudo, não é conhecido se a atividade da via tem algum efeito sobre a quantidade de RNAm e proteína expressos pelos genes do complexo TSC (TSC1, TSC2 e TBC1D7). A proteína unkempt (UNK), codificada pelo gene UNK, é ligante de RNA e regula a expressão de RNAm, em processos de diferenciação neuronal, como parte constituinte de mTORC1. Resultados anteriores do nosso laboratório identificaram a co-expressão do RNAm de TSC1 e UNK em tumores sem alterações patogênicas em TSC1 e TSC2. Pouco se conhece sobre a regulação da expressão dos genes TSC1 e TSC2 na modulação da atividade da via de mTORC1, tampouco se UNK regula a expressão de RNAm de genes dessa via. Objetivos: Os objetivos deste trabalho foram avaliar: (i) o(s) efeito(s) da via de mTOR sobre a quantidade de RNAm e proteínas expressos pelos genes TSC1, TSC2, TBC1D7 e UNK; e (ii) se o silenciamento de UNK por shRNA altera a quantidade das proteínas TSC1 e TSC2 em HEK293T. Métodos: Análises de expressão gênica diferencial foram realizadas em dados de transcriptomas, publicamente disponíveis, obtidos de linhagens celulares HEK293T tratada com rapamicina, SH-SY5Y com knocking down de UNK ou de músculo sóleo de camundongos que haviam sido tratados com rapamicina ou restrição calórica por 15 meses. No laboratório, HEK293T foi tratada com rapamicina por 24 horas. Foi estabelecida uma linhagem celular por transdução de partículas lentivirais modificadas para expressão de shRNA (short-hairpin RNA) para silenciamento de UNK. Análise proteica em blot foi realizada para comparação quantitativa das proteínas-alvo. Resultados: HEK293T submetida à repressão da via de mTORC1 por rapamicina apresentou, após 72 horas, aumento da quantidade de RNAm de TSC2. Os dados de transcriptoma de músculo sóleo de camundongos tratados in vivo por 15 meses com rapamicina revelaram aumento da quantidade de RNAm de Tsc2 e redução do RNAm de Tsc1 e Tbc1d7. Na linhagem humana SH-SY5Y que sofreu knocking down de UNK houve redução do RNAm de TSC2. O estudo das proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7 em linhagem HEK293T não modificada mostrou aumento do nível de UNK 24 horas após carenciamento, que foi mantido durante tratamento consecutivo com rapamicina por mais 24 horas. Foi gerada uma linhagem de HEK293T em que a proteína UNK foi significantemente reduzida. Nela, não se observou alteração da quantidade de nenhuma das três proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7. Conclusões: Nossos dados indicam que a via de mTORC1 tem efeito negativo sobre a quantidade de RNAm de TSC2 em HEK293T e músculo sóleo de camundongo. Em HEK293T, a inatividade da via de mTORC1 aumenta o nível da proteína UNK. A redução da proteína UNK nessa linhagem celular não altera a quantidade das proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7. Em linhagem celular SH-SY5Y, a redução de UNK diminui a quantidade de RNAm de TSC2, corroborando o efeito negativo de mTORC1 observado sobre esse RNAm. Limitações: O estudo tem as limitações de não ter testado alterações da quantidade de RNAm nem ter avaliado o efeito da inibição da via de mTORC1 na linhagem celular geneticamente modificada (shRNA para UNK). Logo, a linhagem celular estabelecida neste projeto de pesquisa será valiosa para se testar o modelo em que a atividade de mTORC1 reduz a quantidade do RNAm de TSC2 e se essa regulação depende de UNK.

Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystemic disease characterized by benign tumors in various organs and caused by pathogenic variants in the tumor suppressor genes TSC1 or TSC2. The TSC1 and TSC2 proteins inhibit the mTORC1 pathway, which is central to the control of cell growth and proliferation. mTORC1 activity has been linked to the differential expression of specific genes. However, it is unknown whether the pathway's activity has any effect on the mRNA and protein levels expressed by the TSC complex (TSC1, TSC2, and TBC1D7). The unkempt protein (UNK), encoded by the UNK gene, is an RNA-binding protein that regulates mRNA expression in neuronal differentiation processes, serving as a constituent of mTORC1. Previous results from our lab identified co-expression of TSC1 and UNK mRNA in tumors without pathogenic alterations in TSC1 and TSC2. There is limited information on the regulation of TSC1 and TSC2 gene expression in modulating mTORC1 pathway activity. Moreover, it is unclear whether UNK regulates mRNA expression of certain genes in this pathway. Aims: The specific aims of this study were to assess (i) the effect(s) of the mTOR pathway on the RNA and protein levels expressed by TSC1, TSC2, TBC1D7, and UNK genes; and (ii) whether shRNA-mediated silencing of UNK alters the protein levels of TSC1 and TSC2 in HEK293T cells. Methods: Differential gene expression analyses were performed on publicly available transcriptome data obtained from HEK293T cells treated with rapamycin, SH-SY5Y cell line submitted to UNK knocking-down, or soleus muscle from mice that had been treated with rapamycin or caloric restriction for 15 months. In the laboratory, HEK293T cells were treated with rapamycin for 24 hours. A cell line was established by transduction of lentiviral particles modified to express short-hairpin RNA (shRNA) targeting UNK. Western blotting was conducted for quantitative comparison of target proteins. Results: HEK293T cells subjected to mTORC1 pathway repression by rapamycin treatment for 72 hours had an increase in TSC2 mRNA levels. Transcriptome analysis of soleus muscle from mice treated in vivo with rapamycin for 15 months revealed an increase in Tsc2 mRNA and a reduction in Tsc1 and Tbc1d7 mRNA. UNK knock-down in human SH-SY5Y cells resulted in a reduction in TSC2 mRNA. Analysis of the TSC1-TSC2-TBC1D7 complex proteins in unmodified HEK293T cells showed an increase in UNK levels 24 hours after starvation, which was maintained during consecutive rapamycin treatment for an additional 24 hours. A HEK293T cell line with significant reduction of UNK protein was generated, and no change was observed in the levels of any of the three TSC1-TSC2-TBC1D7 complex proteins. Conclusions: Our data indicate that the mTORC1 pathway has a negative effect on TSC2 mRNA levels in HEK293T cells and mouse soleus muscle. In HEK293T cells, mTORC1 pathway inactivity increases UNK protein levels. Reduction of UNK protein in this cell line does not alter the levels of the TSC1-TSC2-TBC1D7 complex proteins. In SH-SY5Y cell line, UNK reduction decreases TSC2 mRNA levels, supporting the negative effect of mTORC1 observed on this mRNA. Limitations: This study has the limitation of not having submitted the genetically modified cell line (shRNA for UNK) to specific mRNA quantification assessment or pharmacological repression of the mTORC1 pathway. Therefore, the cell line established in this research project will be valuable for testing the model of mTORC1 regulation of the TSC2 mRNA levels and its dependence on UNK.