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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.41.2013.tde-21032014-090729
Documento
Autor
Nome completo
Fernando Janczur Velloso
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Haddad, Luciana Amaral (Presidente)
Brentani, Helena Paula
Soares Netto, Luis Eduardo
Lopes, Marilene Hohmuth
Ulrich, Alexander Henning
Título em português
Variabilidade do domínio KH-2 da proteína do retardo mental do X frágil (FMRP)
Palavras-chave em português
Domínio KH-Z
FMR1
FMRP
Síndrome do X Frágil
Splicing alternativo
Resumo em português
A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) tem expressão significativa no encéfalo, gônadas e células proliferativas. A FMRP é uma proteína ligante de RNA, repressora traducional, que transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polissomos. Sua associação a RNA pode se dar pelos domínios Tudor N-terminais, dois domínios centrais, com homologia à heteronucleoproteína K (KH) ou motivos RGG, ricos em arginina (R) e glicina (G), C-terminais. A abolição da expressão da FMRP por mutações no gene FMR1 é a causa mais frequente de deficiência intelectual hereditária entre homens. Transcritos desse gene sofrem splicing alternativo de quatro éxons, podendo gerar até 20 isoformas não redundantes da FMRP. A tradução de RNAm do FMR1 contendo o éxon 12 causa uma extensão em fase, em 21 aminoácidos na alça variável do segundo domínio KH (KH-2) da FMRP, cujos padrão de expressão e função ainda são desconhecidos. Embora a FMRP tenha alta similaridade com duas proteínas parálogas, proteínas relacionadas à FMRP, FRX1P e FXR2P, ela apresenta algumas características de expressão e função que lhes são próprias. A longa alça variável do domínio KH-2, por exemplo, não é observada nas parálogas e é característica somente de ortólogas da FMRP em mamíferos. Assim, é possível que o estudo deste segmento da proteína traga informações funcionais específicas para o encéfalo de mamífero. Demonstramos anteriormente, por qRT-PCR, que, em transcritos do Fmr1 de rato, a expressão da sequência do éxon 12 é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal e cerebelo, em relação ao hipocampo. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos, tendo como objetivo a análise cuidadosa da expressão desse éxon em isoformas da FMRP (FMRP+12ISO), pelo uso de um anticorpo dirigido ao segmento codificado por ele, em encéfalos do décimo segundo dia pós-natal (P12, controle positivo) ou embrionários. Para tal, foram realizadas análises por imunoistoquímica e, em P12, ensaios de cromatografia de exclusão molecular de partículas ribonucleoproteicas. Análises de níveis de RNAm e proteicos em fase embrionária (E12 a E20) do encéfalo do rato foram também conduzidas in vivo e in vitro, em cultivo primário de neuroesferas em suspensão, a partir da dissociação de vesículas telencefálicas de ratos em E14. Os dados de imunoistoquímica de encéfalo de ratos em P12 indicaram que (i) as camadas granular externa e a camada piramidal externa do córtex cerebral e as células de Purkinje no cerebelo são mais ricas em FMRP+12ISO; (ii) o giro denteado e CA3 foram fontes de FMRP+12ISO no hipocampo, porém em mais baixa intensidade; e (iii) o conjunto das isoformas da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, foram expressas em região periventricular dos ventrículos laterais em período pós-natal, sugestivo de células-tronco neurais do adulto ou recém diferenciadas. No córtex cerebral, as FMRP+12ISO foram expressas em áreas motora (segmento rostrodorsal), sensorial (segmentos dorsolaterais a laterais), auditiva (segmentos dorsolaterais), olfatória (córtex piriforme) e visual (segmentos ventrolaterais), além da área do cingulado (segmentos mediais) de ambos os hemisférios cerebrais. Os dados também confirmaram que, em P12, as FMRP+12ISO têm expressão mais pronunciada no córtex cerebral e cerebelo do que no hipocampo. À cromatografia, as FMRP+12ISO tiveram o mesmo padrão de distribuição que o conjunto das isoformas da FMRP, fracionando em complexos ribonucleoproteicos maiores que 600 kDa. De modo geral, a expressão das FMRP+12ISO foi baixa em E12 e E14. Houve concordância entre as análises por qRT-PCR, Western blotting e imunoistoquímica, corroborando a baixa expressão do éxon 12 do FMR1 na vesículas telencefálicas em E14. Observamos por imunoistoquímica poucas células sugestivas de progenitoras, na base do neuroepitélio, que expressassem FMRP+12ISO ou outras isoformas da FMRP. O córtex cerebral em E20 foi raramente positivo para FMRP+12ISO ou o conjunto das isoformas da FMRP. Por outro lado, células da camada mais superficial da placa cortical, indicativa de ser a camada I, mostraram expressão de isoformas da FMRP sem o segmento codificado pelo éxon 12 do Fmr1, em E18 e da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, em E20, de forma contínua em várias regiões corticais. Em neuroesferas em suspensão, a expressão das FMRP+12ISO foi muito baixa enquanto isoformas da FMRP, supostamente com a alça variável de KH- 2 em sua conformação curta, tiveram alta expressão nessas células. Desde as primeiras 24 horas sob condições de diferenciação neuronal in vitro, células de neuroesferas aumentaram a expressão das FMRP+12ISO, que se mantiveram alta no período analisado (12 dias in vitro), colocalizando-se com outras isoformas da FMRP. Ensaios preliminares in vitro pela interferência do RNA, em células imortalizadas C6, indicaram um RNA em fita dupla, entre dois testados, com capacidade de inibição de mensagens do Fmr1 que especificamente contenham o éxon 12. A expressão do éxon 12 do FMR1 no córtex cerebral frontal, humano, em envelhecimento foi baixa pela análise de RNAm, enquanto o total de transcritos deste gene apresentou-se em níveis significativos. Nossos dados sugerem que a expressão do éxon 12 do Fmr1 é mais significativa para FMRP+12ISO em células neuronais, durante um período crítico de sinaptogênese, no primeiro mês pós-natal do rato. O tecido telencefálico, embrionário não se mostrou uma fonte rica dessas isoformas, principalmente em células indiferenciadas, que foram francamente negativas
Título em inglês
Variability of the KH-2 domain in fragile X mental retardation protein
Palavras-chave em inglês
Alternative splicing KH-2 protein
FMR1
FMRP
Frágil X syndrome
Resumo em inglês
Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), codified by Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is significantly expressed in the brain, gonads and proliferative cells. FMRP is an RNA-binding protein and acts as a translation repressor, which transits between cell nucleus, cytoplasmic granules and polysomes. Its association with RNA occurs via several domains, namely: Nterminal Tudor domains; two central domains with K-heteronucleoprotein (KH) homology; and C-terminal RGG motifs, that are rich in arginine (R) and glicine (G). The absence of FMRP expression triggered by mutations in the FMR1 gene is the most frequent cause of hereditary intellectual disability in human men. Four FMR1 exons may undergo alternative splicing, generating up to 20 non-redundant FMRP isoforms. The translation of the FMR1 mRNA containing exon 12 leads to an in-phase extension of 21 amino acids in the variable loop on FMRP the second KH domain (KH-2). The pattern of expression and function of this isoform are unknown. Although FMRP is highly similar to two paralogs proteins, FMRP-related proteins FRX1P and FRX2P, it presents some unique expression and function characteristics. The long variable loop of the KH-2 domain, for example, is not observed in these paralogs and is a hallmark of FMRP mammal orthologs. Therefore, the study of this protein segment can potentially bring information about its function specifically in the mammalian brain. Using qRT-PCR and Western blotting, we previously demonstrated that, for rat Fmr1 transcripts, the expression of sequences containing exon 12 is regulated during early postnatal development. In this period, expression of these segments in the frontal cerebral cortex and in the cerebellum is higher when compared to hippocampus expression. In the present work, we deepened these studies with the objective of carefully analysing the expression of FMRP isoforms containing FMRP exon 12 (FMRP+12ISO). For this purpose, we employed rat postnatal brains at the twelfth postnatal day (P12, used as a positive control) and rat embryo brain in immunohistochemistry assays with antibodies detecting peptides codified by exon 12. In this strategy, we also carried out molecular exclusion chromatography of ribonucleoproteins particles with lysates from rat P12 encephalon. Analysis of mRNA and protein levels in rat brain in the embryonic period [embryonic days 12 to 20 (E12 to E20)] were conducted in vivo and in vitro, in neurosphere suspension primary cultures, obtained by dissociation of telencephalic vesicles from E14 rats. Immunohistochemical data from P12 rat brain indicated that (i) the granular external layers and pyramidal external layer in the brain cortex and Purkinje cells in the cerebellum are richer in FMRP+12ISO; (ii) in the hippocampus, FMRP+12ISO can be found in dentate gyrus and CA3, although in lesser intensities; and (iii) FMRP isoforms, including FMRP+12ISO, are expressed in the periventricular regions from the lateral ventricles, suggesting their expression in adult neural stem cells or in differentiating cells. In the cerebral cortex, FMRP+12ISO are expressed in motor areas (rostrodorsal segment) and in sensorial areas (dorsolateral and lateral segments), specifically in auditory (dorsolateral segments), olfactory (piriform cortex) and visual (ventrolateral segments) areas, besides expression in the cingulate área (medial segment) in both hemispheres. Our data also confirmed that, in P12 brain, cerebral cortex and cerebellum have higher FMRP+12ISO expression when compared to the hippocampus. Chromatography data indicated that FMRP+12ISO have the same pattern of distribution than the FMRP isoform group, fractionating in ribonucleoproteics complexes heavier than 600kDa. Altogether, FMRP+12ISO expression is low in E12 and E14 rat brain. qRT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry data were concordant, corroborating the low expression of exon 12 in E14 telencephalic vesicles. In immunohistochemistry images, we observed few cells with progenitor phenotype, at the basal neuroepithelium, expressing FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. In E20, cerebral cortex was rarely positive for FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. Still, cells in the superficial layer of the cortical plate, possibly layer 1, were positive for FMRP isoforms that do not contain the segment codified by exon 12 in E18, brains and positive for the ensemble of FMRP, isoforms, FMRP+12ISO included, in E20 brains, in continuous portions of several cortical regions. In suspension neurosphere cultures, FMRP+12ISO expression was very low, while the expression of FMRP isoforms, supposedly with the variable loop of KH-2 in its short conformation, was high in. After 24 hours under neuron differentiation conditions in vitro, neurosphere cells showed increasing expression of FMRP+12ISO, which remained high during the period analyzed (12 days in vitro), co-localizing with other FMRP isoforms. Preliminary assays using RNA interference in vitro in an immortalized glioma cell lineage (C6), disclosed a double-stranded RNA, among two tested samples, with the ability to suppress exon 12 containig Fmr1 mRNA. The expression of FMR1 transcripts containing exon 12 in aging human brain frontal cortex was low, while total FMR1 transcripts levels were significant. Our data suggest that the expression of exon 12 from Fmr1 is more significant in rat neuronal cells during a critical period of synaptogenesis in the first postnatal month. The embryonic telencephalic tissue is not rich in FMRP+12ISO, which were notably absent from undifferentiated cells
 
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Data de Publicação
2014-04-01
 
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