O arroz é um dos alimentos mais consumidos no mundo, mas o estresse térmico afeta seu rendimento e qualidade dos grãos. Para identificar soluções mecanísticas que melhorem essa cultura diante das ameaças das mudanças climáticas, as respostas moleculares da termotolerância devem ser identificadas. O splicing alternativo de pré-mRNAs é um dos mecanismos envolvidos na resposta das plantas contra estresses, mas pouco se sabe sobre como a variação de isoformas transcritas é regulada por mudanças de temperatura. Os genes de arroz LOC_Os02g40900 e LOC_Os05g30140 são candidatos a reguladores de splicing sensíveis ao calor. Para investigar essa hipótese, foram gerados plasmídeos com base na metodologia CRISPR/Cas9 visando editar esses genes em plantas de arroz. Utilizando a estratégia de duplo direcionamento, foram escolhidas duas sequências-alvo na região codificante de cada gene. Essas sequências-alvo foram inseridas em vetores de expressão de plantas via PCR, subclonagem e Golden Gate Assembly. Os plasmídeos adequados foram confirmados por sequenciamento de Sanger e então inseridos em Agrobacterium, sendo confirmados por PCR de colônias. Para a transformação de plantas, calos de arroz foram obtidos induzindo a divisão de embriões indiferenciados em sementes de arroz. Após a indução e subcultivo dos calos, ocorreu a transformação via Agrobacterium, permitindo que os calos resistentes ao agente seletivo prosseguissem para o meio de regeneração, gerando plantas transgênicas, confirmadas por PCR e sequenciamento de Sanger para, pelo menos, uma das edições esperadas.

Rice is one of the most consumed foods in the world, but heat stress affects its yield and grain quality. To identify mechanistic solutions to improve this crop under climate change threats, the molecular responses of thermotolerance must be identified. Alternative pre-mRNA processing is one of the mechanisms involved in plant response against stresses, but little is known about how the variation of transcribed isoforms is regulated by temperature changes. The rice genes LOC_Os02g40900 and LOC_Os05g30140 are candidates for heat-sensitive splicing regulators. To investigate this hypothesis, it was generated plasmids based on the CRISPR/Cas9 methodology to knock out these genes in rice plants. Using the dual-targeting strategy, it was selected two target sequences in the coding region of each gene. These target sequences were inserted in plant expression vectors via PCR, sub-cloning, and Golden Gate Assembly. The correct plasmids were confirmed by Sanger sequencing and they were then inserted into Agrobacterium and confirmed by colony PCR. For plant transformation, rice calli were obtained by inducing undifferentiated embryo division in rice seeds. After calli induction and subculture, occurred the transformation via Agrobacterium, enabling that the calli resistant to the selective agent proceeded to the regeneration medium, generating transgenic plants, confirmed via PCR and Sanger sequencing for at least one of the expected editions.