A luz ultravioleta (UV), quando incide sobre as células humanas, é capaz de lesionar o DNA, gerando fotoprodutos conhecidos como dímeros de pirimidina, podendo resultar tanto em instabilidade gênica quanto em morte celular. Estas lesões, quando detectadas pela célula recrutam proteínas responsáveis pelo reparo por excisão de nucleotídeos (do inglês, NER). Caso não sejam reparadas até o momento da replicação, estas lesões bloqueiam a polimerase replicativa, sinalizando para um mecanismo de tolerância conhecido como síntese translesão (do inglês, TLS). Nesse processo, polimerases específicas, chamadas polimerases de TLS, são recrutadas para o local e realizam o bypass da lesão, permitindo à célula continuar a replicação. Dentre as polimerases de TLS descritas, a Polη (Pol eta) é a mais estudada, devido ao fato de a sua ausência levar a uma síndrome conhecida como xeroderma pigmentosum variante (XP-V), em que os pacientes apresentam hipersensibilidade à luz UV e aumento da incidência de tumores em regiões expostas ao sol. Apesar de diversos estudos, ainda não se sabe como a TLS dos dímeros ocorre nestes pacientes, deixando em aberto uma questão que implica, diretamente, na alta frequência de tumores de pele em pessoas XP-V. Sabe-se que a Polι (Pol iota), outra polimerase, está presente em foci de replicação, juntamente com a Polη, porém sua função na TLS ainda não está definida. Nesse contexto, o objetivo principal do presente projeto é investigar o papel de Polι no bypass de lesões UV em células humanas. Para isso, utilizou-se linhagens celulares deficientes em NER (XP-C) silenciadas para Polι e/ou Polη, previamente estabelecidas em nosso laboratório. Estas linhagens foram expostas a diferentes doses de luz UVC para a análise de viabilidade celular, morte celular (sub-G1 e ativação de caspase-3), progressão no ciclo, capacidade de migração e duplicação, quantificação da sinalização do dano, bloqueio da forquilha de replicação pelos dímeros de pirimidina e quantificação de quebras no DNA. Os resultados presentes nesta tese mostraram que a perda apenas de Polι não afeta a linhagem na maioria das metodologias. Entretanto, após a retirada de Polι de células que já não possuíam Polη, observou-se uma redução acentuada da resistência da linhagem à luz UV, com morte elevada (24, 48 e 72 h após o tratamento) e bloqueio em fase G1/S do ciclo celular, porém sem aumento na sinalização do dano. Além disso, esta linhagem apresentou problemas na duplicação e migração celular após a irradiação com UVC e parada acentuada de forquilhas de replicação. Por fim, a quantificação de quebras 24 h após a irradiação evidenciou que a hipersensibilidade desta linhagem não é devido ao aumento da fragmentação do DNA, e sim uma incapacidade da célula em lidar com o dano quando ambas as polimerases de TLS estão ausentes. Baseado nestes resultados, concluiu-se que Polι atua de fato como backup na ausência de Polη na TLS de fotoprodutos. Também estudamos células mutadas em PCNA. Dados preliminares mostraram que esta mutação torna a linhagem mais sensível a lesões do tipo quebra-dupla e termosensibilidade, sendo interessante para o estudo da replicação e reparo de DNA.

When the ultraviolet (UV) light reaches human cells, it damages the DNA, generating photoproducts known as pyrimidine dimers, which can result in both gene instability and cell death. These lesions, when detected by the cell, recruit proteins responsible for nucleotide excision repair (NER). If not repaired properly by the time of replication, these lesions block the replicative polymerase, signaling to a tolerance mechanism known as translesion synthesis (TLS). In this process, specific specific polymerases, called TLS polymerases, are recruited to the site to bypass the lesion, allowing the cell to continue replication. Among the described TLS polymerases, Polη (Pol eta) is the most studied, since its absence leads to a syndrome known as xeroderma pigmentosum variant (XP-V), in which patients have hypersensitivity to UV light and an increased incidence of tumors in regions exposed to the sunlight. Despite several studies, it is still not known how TLS occurs in the tolerance of photoproducts in these patients, leaving open a question that directly implies in the high frequency of skin tumors in XP-V people. It is known that Polι (Pol iota), another polymerase, is present in replication foci, along with Polη, but its role in TLS is not yet defined. In this context, the main objective of the present project is to investigate the role of Polι in the bypass of UV-lesions in human cells. For this, NER-deficient cell lines (XP-C) silenced for Polι and/or Polη, previously established in our laboratory, were used. These lineages were exposed to different doses of UVC light for the analysis of cell viability, cell death (sub-G1 and caspase-3 activation), cycle progression, migration and duplication capacities, quantification of signaling damage, blockage of the replication fork by pyrimidine dimers, and quantifying DNA breaks. The results presented in this thesis showed that the loss of Polι alone does not affect the lineage in most of the processes. However, after removal of Polι from cells that lack Polη, an evident reduction in the resistance of the strain to UV light was observed, with high death (24, 48 and 72 h after treatment) and G1/S cell cycle arrest, but no increase in damage signaling. In addition, this cell lineage presented problems in duplication and migration after UVC irradiation and severe replication fork blockage, higher than the other cell lineages. Finally, the quantification of breaks 24 h after irradiation showed that the hypersensitivity of this cells is not due to an increase in DNA fragmentation, but an inability of the cell to deal with the damage when both TLS polymerases are absent. Based on these results, it was concluded that Polι is indeed the backup of Polη in the TLS of photoproducts. We also studied PCNA-mutated patient cells. Preliminary data showed that the mutation makes the cell line more sensitive to double stranded breaks lesions and presents thermosensitivity, which is an interesting finding in the study of DNA replication and repair.