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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.42.2011.tde-12082011-135929
Documento
Autor
Nome completo
Rodrigo Nalio Ramos
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Barbuto, Jose Alexandre Marzagao (Presidente)
Câmara, Niels Olsen Saraiva
Chammas, Roger
Título em português
Investigação de um possível viés imunossupressor em células dendríticas derivadas de indivíduos portadores de cancêr.
Palavras-chave em português
Células cultivadas de tumor
Células dendríticas
Citometria de fluxo
Linfócitos T
Neoplasias
Tolerância imunológica
Resumo em português
As células dendríticas (DCs) são as mais eficazes células apresentadoras de antígenos. Mesmo com a possibilidade da geração de DCs in vitro, que permitiu a criação de protocolos de vacinação antitumoral, mecanismos de tolerância periférica, mediados por células T reguladoras, impedem uma resposta imune antitumoral eficaz. O presente estudo visou avaliar, in vitro, a geração de linfócitos T reguladores por células dendríticas derivadas de pacientes portadoras de câncer de mama. Para tanto, DCs foram diferenciadas a partir de monócitos do sangue periférico de pacientes com câncer, por sete dias, na presença de GM-CSF e IL-4 (DCs imaturas - iDCs), e ativadas, por adição de TNF-a no dia cinco de cultura (DCs maduras - mDCs). As DCs foram caracterizadas, por citometria de fluxo, quanto à: expressão de CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC e HLA-DR; produção de IL-10 e TGF-beta1, por ELISA; e ainda em ensaio funcional, que se deu pela co-cultura das DCs com linfócitos T (CD3+, CD3+CD25neg ou CD4+CD25neg), isolados por microsferas imunomagnéticas. Após co-cultura, a expressão de CD25, a proliferação (diluição de CFSE), a produção de citocinas (IFN-g, IL-10, TGF-beta1) e a geração de células Tregs foram analisadas. As células foram caracterizadas como Tregs por seu fenótipo (CD4+CD25+CD127lowCTLA-4+Foxp3+) e sua capacidade supressora sobre linfócitos alogeneicos. iDCs de pacientes apresentaram aumento da expressão de CD86 (com duas subpopulações: CD86High e CD86Low) e CD123 além de produção elevada de IL-10 e TGF-beta1 bioativo. Co-culturas com DCs de pacientes apresentaram níveis altos de TGF-beta1 bioativo (298,08 pg/ml x ctrl: 57,63 pg/ml) e induziram um alta freqüência de Tregs (iDCs: 57% ± 4,1; mDCs: 48% ± 5,0 x ctrl: 2,5% ± 0,7) a partir de precursores CD25negFoxp3neg, que foram capazes de suprimir a proliferação de linfócitos alogeneicos. O bloqueio de TGF-beta nas co-culturas reduziu parcialmente a freqüência de Treg geradas por DCs de pacientes. Esses achados são condizentes com a alta freqüência de Tregs no sangue periférico dessas mesmas pacientes (19,5% ± 2,3 x 8% ± 2,3) e com a presença de células com fenótipo de DCs no sangue, apresentando marcação semelhante a iDCs geradas in vitro. Por outro lado, iDCs provenientes de doadoras saudáveis induziram estimulação linfocitária mais intensa (35,7% ± 7,9 x 11,8 ± 5,9% CD25+), intensa proliferação de linfócitos CD4+ (82,7% x 29,4%) e CD8+ (73,8% x 21%) e alta produção de IFN-g (109,85 pg/ml x 7,86 pg/ml) nas co-culturas. Estes dados indicam que DCs derivadas de monócitos de pacientes com câncer de mama apresentam um viés imunossupressor que não é estritamente dependente do seu status de maturação ou de TGF-beta. Esses achados além de contribuir para a compreensão das interações entre o sistema imune e as neoplasias, devem ser considerados no delineamento de protocolos imunoterapêuticos baseados em DCs.
Título em inglês
Investigation of a possible immunosuppressive bias in dendritic cells derived from cancer patients.
Palavras-chave em inglês
Cancer
Cultured tumor cells
Dendritic cells
Flow cytometry
Immunological tolerance
T lymphocytes
Resumo em inglês
Dendritic cells (DCs) are the most effective professional antigen-presenting cells. Even considering the possibility of generating DCs in vitro, which allowed the design of antitumor vaccination protocols, mechanisms of peripheral tolerance mediated by regulatory T cells prevent an effective antitumor immune response. The aim of our study was evaluate, in vitro, the induction of regulatory T cells by dendritic cells derived from breast cancer patients.DCs were differentiated from breast cancer patients blood monocytes, for seven days, in the presence of GM-CSF and IL-4 (immature DCs- iDCs) and activated by TNF-a on day five of culture (mature DCs- mDCs). DCs were characterized by flow cytometry to CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC and HLA-DR expression; the cytokine secretion to IL-10 and bioactive TGF-beta1, by ELISA; and in functional assay by co-culturing DCs with T lymphocytes (CD3+, CD3+CD25neg or CD4+CD25neg) isolated by microbeads. Cell activation (CD25 expression), proliferation (CFSE dilution), cytokine production (IFN-gamma, IL-10 and TGF-beta1) and de novo regulatory T cells (Tregs) generation, were analyzed in these co-cultures after 5 or 6 days. Tregs were characterized by their phenotype (CD4+CD25+CD127LowCTLA-4+Foxp3+) and suppressive capability on allogeneic T cell proliferation. Patients iDCs showed a higher expression of CD86 (two subpopulation: CD86High and CD86Low) and CD123 beyond the elevated production of IL-10 and bioactive TGF-beta1. Co-cultures using patients DCs presented high levels of bioactive TGF-beta1 (298.08 pg/ml x ctrl: 57.63 pg/ml) and induced elevated frequency of Tregs (iDCs: 57% ± 4.1; mDCs: 48% ± 5.0 x ctrl: 2.5% ± 0.7) from CD25neg Foxp3neg precursors, which were able to suppress the allogeneic lymphocyte proliferation. The TGF-beta blocking partially reduced the frequency of induced Tregs by patients DCs. These findings are consistent with the higher frequency of Tregs on peripheral blood of those patients (19.5% ± 2.3 x ctrl 8% ± 2.3) and the presence of DCs also on the blood, showing similar markings with iDCs generated in vitro. Contrastingly, iDCs from healthy donors were better stimulator cells, leading to a higher CD25+ cell frequency (ctrl 35.7% ± 7.9 x 11.8 ± 5.9% CD25+), more intense proliferation of CD4+ (82.7% x 29.4%) and CD8+ (73.8% x 21%) cells and higher production of IFN-gamma (109.85 pg/ml x 7.86 pg/ml) on co-cultures. These data indicate that DCs derived from breast cancer patients show an immunosuppressive bias that is not strictly dependent on DCs maturation status or TGF-beta. Finally, these observations call to caution in the use of patients monocytes for the generation of DC-based vaccines and also contribute to the comprehension of the interactions between the immune system and cancer.
 
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Data de Publicação
2011-08-24
 
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  • RAMOS, R. N., et al. Monocyte-derived dendritic cells from breast cancer patients are biased to induce CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells [doi:10.1189/jlb.0112048]. Journal of Leukocyte Biology [online], 2012, vol. 92, n. 3, p. 673-682.
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