O fármaco de primeira escolha no tratamento da leishmaniose tegumentar no Brasil, onde Leishmania (Viannia) braziliensis é o principal agente etiológico da doença, é o antimoniato de meglumina, de uso parenteral e com eficácia tão baixa quanto 50% em algumas regiões do país. Com o objetivo de avaliar o potencial da miltefosina para o tratamento de leishmaniose tegumentar no Brasil, caracterizamos a suscetibilidade de 16 isolados clínicos brasileiros e duas cepas referência de L. (V.) braziliensis a este fármaco. Observamos variabilidade caracterizada por valores de EC50 6 e 15 vezes maiores, em formas promastigota e amastigota, respectivamente, entre os isolados mais e menos suscetíveis ao fármaco. Buscamos entender as bases moleculares envolvidas nessas diferenças de suscetibilidade intrínseca através da caracterização, nesses isolados, de alguns dos mecanismos de resistência à miltefosina mais conhecidos em Leishmania. Para isso, elegemos os isolados com menor e maior EC50 em paralelo à cepa referência. Observamos diferenças na velocidade de entrada do fármaco e de sua acumulação entre os isolados, que se revelaram reduzidas nos isolados menos suscetíveis quando comparados com isolados mais suscetíveis e a cepa referência. Polimorfismos nos genes que codificam a maquinaria de transporte de miltefosina e diferenças nas taxas de efluxo/metabolismo, fitness e compartimentalização de fármacos não apresentaram um padrão que pudesse ser correlacionado à diferença de susceptibilidade ao fármaco. Com o objetivo de ampliar a busca por mecanismos de modulação da suscetibilidade à miltefosina nestes isolados, obtivemos o sequenciamento dos transcriptomas, que revelou a presença de 36 genes diferencialmente expressos entre os isolados polares. Dentre eles observamos um aumento na abundância do mensageiro que codifica a proteína Ros3 no isolado mais suscetível. Essa proteína compõe o complexo transportador MT-Ros3, considerado como a principal via de entrada de miltefosina em Leishmania. Portanto, as diferenças na suscetibilidade e absorção de miltefosina poderiam estar relacionadas à abundância de Ros3. Demonstramos que a abundância de mRNA Ros3 e o número de cópias do gene eram maiores no isolado mais sensível. Para a validação funcional do papel da dosagem gênica de Ros3 na diferença de suscetibilidade à miltefosina utilizamos duas abordagens, a superexpressão de Ros3 no isolado menos sensível à miltefosina e em L. (L.) major e o nocaute parcial e completo deste gene em L. (L.) major. Observamos um aumento de pelo menos 40 vezes na abundância de mRNA de Ros3 nos superexpressores. No entanto, não houve redução significativa na EC50 desses parasitas para miltefosina. A deleção parcial ou completa deste gene, por sua vez, resultou em um aumento significativo de 3 e 20 vezes, respectivamente, na EC50 de L. (L.) major para miltefosina, validando a participação da proteína Ros3 na expressão do fenótipo de suscetibilidade à miltefosina. Em conclusão, mostramos que variabilidade na suscetibilidade à miltefosina ocorre entre isolados clínicos de L. (L.) braziliensis independentemente de exposição prévia ao fármaco. Mostramos ainda que um dos fatores implicados nesse fenótipo é a modulação da abundância de Ros3 ao mesmo tempo que evidenciamos que essa proteína não é a única responsável pela suscetibilidade dos parasitas.

The first choice drug for leishmaniasis treatment in Brazil, where Leishmania (Viannia) braziliensis is the main etiological agent, is meglumine antimoniate, which is used by the parenteral route. Its efficacy can be as low as 50% in some Brazilian regions. Aiming to evaluate the potential of miltefosine for tegumentary leishmaniasis treatment in Brazil, weve characterized the susceptibility of 16 Brazilian clinical isolates and two reference strains of L. (V.) braziliensis to this drug. Susceptibility measured by EC50 varied by 6 and 15-fold, in promastigotes and amastigotes, respectively. Aiming to understand the molecular bases involved in determining the intrinsic susceptibility in these isolates, we chose the isolates presenting the lowest and highest EC50 for the characterization of some of the known mechanisms of resistance to miltefosine in Leishmania. We observed differences in the speed of drug uptake and accumulation between the isolates, which were reduced in the less susceptible when compared to more susceptible isolates and the reference strain. Polymorphisms in the genes coding for the miltefosine transport machinery and differences in the efflux/metabolism, fitness and drug compartmentalization rates did not show a pattern that could be correlated to the differences in drug susceptibility. In order to expand the search for mechanisms modulating susceptibility to miltefosine in these isolates, we looked at their sequenced transcriptome, which revealed the presence of 36 differentially expressed genes between the polar isolates. Among them, we observed an increase in the abundance of Ros3 encoding RNA in the most susceptible isolate. The Ros3 protein is a component of the MT-Ros3 transporter complex, considered as the main route of miltefosine entry in Leishmania. Therefore, the abundance of Ros3 could be related to differences in miltefosine uptake and susceptibility. We demonstrated that the abundance of Ros3 mRNA and gene copy number were increased in the most sensitive isolate. For the functional validation of the role of Ros3 gene dosage in the differential susceptibility to miltefosine we used two approaches, the overexpression of Ros3 in the less sensitive isolate and in L. (L.) major, and the partial and complete knockout of this gene in L. (L.) major. The abundance of Ros3 mRNA was increased at least 40-fold in overexpressing clones. However, there was no significant reduction in the EC50 for miltefosine in these parasites. The partial or complete deletion of Ros3, in turn, resulted in a significant increase of 3 and 20 times, respectively, in the EC50 of miltefosine in mutant L. (L.) major, validating the participation of the Ros3 protein in the susceptibility phenotype to miltefosine. In conclusion, we showed that susceptibility to miltefosine varies among clinical isolates of L. (V.) braziliensis regardless of previous exposure to the drug. Our data indicate that Ros3 cannot be considered the only player modulating Leishmania susceptibility to miltefosine. Nonetheless, we unequivocally showed that the modulation of Ros3 abundance is one of the factors involved in this phenotype.