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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.46.2012.tde-04092012-112933
Document
Auteur
Nom complet
Chrislaine Oliveira Soares
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2012
Directeur
Jury
Bechara, Etelvino Jose Henriques (Président)
Mascio, Paolo Di
Meotti, Flavia Carla
Rettori, Daniel
Silber, Ariel Mariano
Titre en portugais
Mecanismos moleculares da ação tóxica pró-oxidante de 1,4-diamino-2-butanona, um análogo de putrescina, sobre células de mamíferos e Trypanosoma cruzi
Mots-clés en portugais
α-Aminocetona
1,4-diamino-2-butanona
Células LLC-MK2
Células RKO
Espécies reativas de oxigênio
Trypanosoma cruzi
Resumé en portugais
Compostos α-aminocarbonilícos como ácido 5-aminolevulínico (ALA) e aminoacetona (AA) apresentam um grande potencial pró-oxidante, pois sofrem reações de enolização e subseqüente oxidação aeróbica, com a formação de espécies radicalares de oxigênio, íons NH4+ e α-oxoaldeídos potencialmente citotóxicos. A α-aminocetona 1,4-diamino-2-butanona (DAB), um análogo da putrescina, é um agente microbicida de vários parasitas incluindo Trypanosoma cruzi. Acredita-se que o mecanismo de morte desencadeado por DAB nos parasitas seja por meio da inibição competitiva da ornitina descarboxilase (ODC), importante enzima do metabolismo de poliaminas, muito embora tenha sido observado de igual forma danos oxidativos nestes parasitas quando tratados com DAB. O objetivo deste trabalho é esclarecer o mecanismo de oxidação química de DAB e sua ação pró-oxidante à cultura de células de mamíferos (LLC-MK2 e RKO), assim como sua atividade microbicida contra tripomastigotas de Trypanosoma cruzi. Demonstramos aqui que DAB, quimicamente similar ao ALA e AA, sofre reação de oxidação catalisada por íons fosfato, e por íons de metais de transição como Fe(II) e Cu(II), resultando na formação de radicais de oxigênio, H2O2, NH4+, 2-oxo-4-aminobutanal como produto principal da oxidação de DAB e de compostos ciclicos de caracter pirrólico. Danos oxidativos observados em ferritina, apotransferrina e liposomos de cardiolipina e fosfatidilcolina (20:80) contribuem para a nossa hipótese de ação pró-oxidante de DAB. O tratamento de células de mamíferos das linhagens LLC-MK2 (IC50 1,5 mM, tratamento de 24 h) e RKO (IC50 0,3 mM, tratamento de 24 h) com DAB levou à alteração do balanço redox celular, à ativação de resposta antioxidante e ao desencadeamento de morte celular via apoptose e parada de ciclo celular. Em culturas de tripomastigotas de T. cruzi o tratamento com DAB culminou na redução da motilitidade e viabilidade destes parasitas (IC50 0,2 mM, tratamento de 4 h), assim como depleção do conteúdo tiólico acompanhado pelo aumento da atividade de TcSOD. Além do mais, DAB mostrou-se eficiente em limitar a invasão de tripomastigotas às células hospedeiras (LLC-MK2) e reduzir a proliferação de amastigotas intracelulares, contudo fortemente relacionada à necrose das células hospedeiras infectadas, uma vez que são alvos mais susceptíveis de ação oxidativa. Estes resultados suportam nossa hipótese que DAB exerce ação pró-oxidante e contribui deste modo com o mecanismo já descrito de morte celular associada à inibição da biossíntese de poliaminas em vários microorganismos.
Titre en anglais
The Molecular mechanisms of pro-oxidant activity of 1,4-diamino-2-butanone, a putrescine analogue, to mammalian cells and Trypanosoma cruzi
Mots-clés en anglais
α-Aminocetona
1,4-diamino-2-butanone
LLC-MK2 cells
Reactive oxygen species
RKO cells
Trypanosoma cruzi
Resumé en anglais
α-Aminocarbonyl componds such as 5-aminolevunilic acid (ALA) and aminoacetone (AA) have been shown to exhibit pro-oxidant properties. These compounds undergo phosphate-catalyzed enolization in physiological pH and subsequent aerobic oxidation, yielding reactive oxygen species, NH4+ ions and an α-oxoaldehyde highly cytotoxic. The α-aminoketone 1,4-diamino-2-butanone (DAB) is a putrescine analogue and a microbicidal agent to various parasites including Trypanosoma cruzi. The mechanism of DAB toxicity to these parasites is attributed to DAB competitive inhibition of ornithine decarboxylase (ODC), a key enzyme on polyamine biosynthesis, although it has also been shown DAB isto implicated in oxidative damage to these parasites. Our aim is to clarify the mechanism of DAB aerobic oxidation and of its putative pro-oxidant activity to mammalian cell cultures (LLC-MK2 and RKO cell linages) and to Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Here we show that, similar to ALA and AA, DAB undergoes aerobic oxidation in presence of phosphate ions and of transition metal ions such as Fe(II) and Cu(II), yielding oxygen radicals, H2O2, NH4+ and 2-oxo-4-aminobutanal accompanied by its condensation cyclic products displaying pyrrolic characteristics. Oxidative alterations to ferritin, apotransferrin and liposomes of cardiolipin and phosphatidylcholine (20:80) were observed under DAB treatment strongly supporting our hypothesis of DAB pro-oxidative activity. DAB treatment of mammalian cultured cells LLC-MK2 (IC50 1.5 mM, 24 h incubation) and RKO (IC50 0.3 mM, 24 h incubation) resulted in redox imbalance, induction of antioxidant response, activation of apoptosis pathway and cell cycle arrest. DAB is shown here to trigger Trypanosoma cruzi trypomastigotes decreased parasite motility and viability (IC50 0.2 mM, 4 h incubation), as well as redox thiol imbalance parallel to increase TcSOD activity. In addition, DAB efficiently hampered host cell (LLC-MK2) invasion by trypomastigotes. In addition, intracellular amastigotes showed to be susceptible to DAB toxicity, although strongly related to necrosis of infected host cells, which are more vulnerable to oxidative stress. Altogether, these data support our hypothesis that oxidative stress contributes to DAB cytotoxicity.
 
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Date de Publication
2012-10-27
 
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