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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2017.tde-06072017-135218
Documento
Autor
Nome completo
Eduardo Shigueo Kitano
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2017
Orientador
Banca examinadora
Serrano, Solange Maria de Toledo (Presidente)
Labate, Carlos Alberto
Nishiyama Junior, Milton Yutaka
Ronsein, Graziella Eliza
Título em português
Estudo do proteoma de folhas de cultivares e genótipos de cana-de-açúcar
Palavras-chave em português
Folha de cana-de-açúcar
Fosfoproteômica
Proteômica
Saccharum officinarum
Saccharum spontaneum
SP80-3280
Resumo em português
A cana-de-açúcar, uma das maiores culturas agrícolas no mundo, é uma antiga fonte de energia para os seres humanos e mais recentemente, tem sido utilizada como fonte para a produção de etanol. Em estudos moleculares sobre a cana-de-açúcar, sua complexidade genética e o fato de seu genoma não estar completamente sequenciado, dificultam a análise dos proteomas de seus diferentes tecidos. Recentemente, em um estudo de um grupo brasileiro sobre os transcriptomas de vários tecidos de cana-de-açúcar, 17.563 transcritos completos foram sequenciados, os quais correspondem a aproximadamente 53% do genoma predito desta planta. Entretanto, sabe-se que o conteúdo de mRNA nem sempre se correlaciona diretamente com os níveis de expressão de proteínas. Dessa forma, a caracterização do proteoma é importante para identificar as proteínas que são de fato expressas, em complementaridade aos estudos sobre o genoma, e fornece informação preditiva sobre a composição do proteoma de diferentes cultivares. Entretanto, estudos sobre folhas de cana-de-açúcar são raros. Neste estudo, com o objetivo de caracterizar o proteoma de folhas +1 de cana-de-açúcar, foram selecionadas duas espécies ancestrais (Saccharum officinarum [S. off] e S. spontaneum [S. sp]) e uma cultivar híbrida (SP80-3280 [SP]), as quais diferem-se na capacidade de produção de sacarose e na resistência a patógenos. A análise de parâmetros fisiológicos (taxa de fotossíntese, condutância estomática, taxa de transpiração e eficiência no uso de água), em folhas de 12 meses revelaram que em S. off e SP existe uma relação melhor entre o número de moléculas de água perdidas na transpiração e o número de moléculas de CO2 assimiladas na fotossíntese do que em S. sp. Os mesmos parâmetros foram avaliados em folhas +1 de SP com 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento e revelaram o papel dos estômatos na manutenção do potencial hídrico das folhas, atuando na modulação da taxa de respiração em resposta às mudanças ambientais, entretanto sem induzir alterações drásticas na taxa de fotossíntese, no período avaliado neste estudo. Com o objetivo de obter proteínas em condições ótimas para análise proteômica, foram testados diferentes métodos de extração de proteínas, que foram avaliados quanto ao rendimento e perfil eletroforético das proteínas extraídas, e selecionado um protocolo que utiliza uma combinação de fenol e dodecil sulfato de sódio para este estudo. Para caracterizar e comparar os proteomas de folhas +1 de S. off, S. sp e SP, foram utilizadas as abordagens proteômicas Shotgun/bottom-up, GeLC-MS/MS e Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) (off-line e "on-line"), e as plataformas MaxQuant e Perseus, como ferramentas de bioinformática para análise dos dados. Os dados obtidos por meio destas abordagens foram combinados e resultaram na identificação de 5.825 grupos de proteínas em folhas +1 de S. off, S. sp e SP, e a análise de enriquecimento de termos pelo Gene Ontology destacou a natureza fotossintética desses proteomas, além da representatividade de organelas envolvidas em processos de fotossíntese e metabolismo de carbono. A análise quantitativa comparativa dos 1.060 grupos de proteínas identificados por meio da abordagem Shotgun/bottom-up revelou que 120 proteínas encontravam-se diferencialmente expressas em folhas de S. off, S. sp e SP, e destas, aquelas que mostraram diferença em abundância de pelo menos quatro vezes, são relacionadas com processos biológicos envolvidos com os estresses biótico e abiótico (resposta a outros organismos, resposta ao íon cádmio, defesa contra fungos e defesa ao estresse oxidativo). Para a análise da variação ontogenética no proteoma de folhas +1 de SP (de 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento) foi aplicada a abordagem Shotgun/bottom-up, que resultou na identificação de 5.780 peptídeos, correspondendo a 1.615 grupos de proteínas únicos. Sessenta e cinco proteínas foram identificadas com abundância diferencial entre as amostras, e a análise de agrupamento hierárquico revelou que as folhas de 13 meses mostraram um perfil mais distinto, enquanto que as outras formaram um grupo separado. A caracterização dos fosfoproteomas de folhas +1 de S. off, S. sp e SP utilizando a abordagem Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) como método de enriquecimento de fosfopeptídeos, e identificação por LC-MS/MS, resultou na identificação de 633 fosfopeptídeos únicos em 515 proteínas. A caracterização dos fosfoproteomas de folhas +1 de SP (de 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento) utilizando a abordagens IMAC e Hydroxy Acid-Modified Metal Oxide Chromatography (HAMMOC) como métodos de enriquecimento de fosfopetídeos, e identificação por LC-MS/MS, resultou na identificação de 558 fosfopeptídeos únicos em 413 proteínas. Em ambas análises, foram identificadas várias proteínas quinases fosforiladas, e de forma geral, a análise de enriquecimento de termos pelo Gene Ontology revelou o núcleo e o citoplasma, entre os componentes celulares, e a regulação da transcrição, a resposta ao estresse abiótico e a glicólise, entre os processos biológicos, como os termos mais enriquecidos. Este é o primeiro estudo objetivando a caracterização dos proteomas totais de folhas de cultivares e genótipos de cana-de-açúcar no Brasil, e seus resultados representam um significante esforço para o uso de diferentes abordagens de proteômica para aprofundar o conhecimento sobre os complexos processos fisiológicos que modulam o crescimento e a performance em cana-de-açúcar
Título em inglês
Study on the leaf proteome of sugarcane cultivars and genotypes
Palavras-chave em inglês
Phosphoproteomics
Proteomics
Saccharum officinarum
Saccharum spontaneum
SP80-3280
Sugarcane leaf
Resumo em inglês
Sugarcane, one of the major crops worldwide, is an old energy source for humans and, more recently, has been used as a source for ethanol production. In sugarcane molecular studies, its complex genetic background and the lack of a complete genome sequencing hinder the analysis of proteomes of different tissues. Recently, in a Brazilian research study focused on the transcriptomes of different sugarcane tissues, 17,563 full-length transcripts were sequenced and covered approximately 53% of the predicted sugarcane genome. However, it is known that mRNA levels are not always directly correlated with protein expression levels. Therefore, the study of the sugarcane proteome is important to identify proteins that are actually expressed, complementing the genome studies, and provides predictive information on the proteome composition of different cultivars. However, studies on sugarcane leaves are rare. In this study, with the aim of characterizing the proteome of sugarcane +1 leaves, we selected two ancestral species (Saccharum officinarum [S. off] and S. spontaneum[S. sp]), and a hybrid cultivar (SP80-3280 [SP]), which differ in sucrose production and pathogen resistance. The analysis of physiological parameters (photosynthesis rate, stomatal conductance, transpiration and efficiency in water use) of 12 month-old +1 leaves revealed that in S. off and SP there is a better relationship between the number of H2O molecules lost by transpiration and the number of CO2 molecules assimilated upon photosynthesis than in S. sp. The same parameters were evaluated in +1 leaves of SP upon 4, 8, 11 and 13 months of growth and revealed the role of stomata in the maintenance of leaf water potential, acting in the modulation of the transpiration rate in response to environmental changes, however without inducing drastic changes in the photosynthesis rate, during the period evaluated in this study. In order to obtain proteins in optimal conditions for proteomic analysis, we carried out different protein extraction methods and evaluated the yield and electrophoretic profiles of extracted proteins, and selected a protocol using a combination of phenol and sodium dodecyl sulfate to carry out this study. To characterize and compare the +1 leaf proteomes of S. off, S. sp and SP we used Shotgun/bottom-up, GeLC-MS/MS and Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) (off-line and "on-line") as proteomic approaches, and the software MaxQuant and Perseus as bioinformatic tools for data analysis. The combined results of these approaches allowed for the identification of 5,825 protein groups in +1 leaves of S. off, S. sp and SP, and the Gene Ontology enrichment analysis highlighted the photosynthetic nature of these proteomes, along with high representativeness of organeles involved in the processes of photosynthesis and carbon metabolism. The comparative quantitative analysis of 1,060 protein groups identified using the Shotgun/bottom-up approach revealed that 120 proteins were differentially expressed in +1 leaves of S. off, S. sp and SP, and of these, those that showed at least a 4-fold change are related to biological processes involved in both abiotic and biotic stress (response to other organism, response to cadmium ion, defense response to fungus, and defense to oxidative stress). For the analysis of the ontogenetic variation in the proteome of +1 leaves of SP (of 4, 8, 11 and 13 months old plants) the Shotgun/bottom-up proteomic approach was employed and resulted in the identification of a total of 5,780 peptides corresponding to 1,615 unique protein groups. Sixty five proteins were identified as differentially abundant between the samples and a hierarchical cluster analysis revealed that the 13 months-old leaves showed the most distinct profile, while the others clustered together. The characterization of the phosphoproteomes of +1 leaves of S. off, S. sp and SP using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) as an enrichment method for phosphopeptides, and LC-MS/MS analysis, resulted in the identification of 633 unique phosphopeptides in 515 proteins. The characterization of the phosphoproteome of +1 leaves of SP (of 4, 8, 11 and 13 months old plants) using IMAC and Hydroxy Acid-Modified Metal Oxide Chromatography (HAMMOC) as enrichment methods for phosphopeptides, and LC-MS/MS analysis, resulted in the identification of 558 unique phosphopeptides in 413 proteins. In both analyses various phosphorylated kinases were identified, and the overall Gene Ontology enrichment analysis showed as most enriched terms nucleus and cytoplasm, as cellular components, and regulation of transcription, response to abiotic stress and glycolysis in biological process. This is the first study to characterize the whole proteome of leaves from sugarcane cultivars and genotypes in Brazil, and its results constitute a significant effort to use different proteomic approaches to advance the knowledge on the complex physiological processes modulating sugarcane growth and performance
 
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Data de Publicação
2017-07-13
 
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