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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.46.2018.tde-08102018-151457
Document
Auteur
Nom complet
Sandro Fernandes Ataide
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2001
Directeur
Jury
Farah, Chuck Shaker (Président)
Marana, Sandro Roberto
Tanaka, Aparecida Sadae
Titre en portugais
Modificações no sítio ativo da triptofanil tRNATRP sintetase de E. coli
Mots-clés en portugais
Biologia molecular
Escherichia coli (Alteração)
Mutagênese
Proteínas recombinantes
Resumé en portugais
As aminoacil-tRNA sintetases catalisam fielmente a ligação do aminoácido ao seu tRNA cognato. A triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) catalisa a ligação de triptofano e alguns análogos de triptofano ao tRNATrp. 1-metiltriptofano (1MW) e 1-metil-7-azatriptofano (1M7NW) não são reconhecidos pela TrpRS, mas possuem características espectroscópicas convenientes para estudos de fluorescência em complexos multiprotéicos. O objetivo deste trabalho é modificar o sítio ativo da TrpRS de E.coli, visando promover a catálise da ligação de 1MW e 1M7NW ao tRNATrp in vivo e permitir a incorporação destes em proteínas recombinantes. Com base numa análise da estrutura da TrpRS:Trp-AMP de B. Stearothermophilus, foram produzidos quatro mutantes de TrpRS de E. coli, com substituição do Asp 135 por Ala (D135A), Cys (D135C), Ser (D135S) e Thr (D135T). Estas proteínas foram superexpressas nas condições utilizadas para a incorporação de análogos de Trp. Através de ensaio de fluorescência do 1MW, pôde-se observar uma pequena incorporação deste nas TrpRS mutantes. Construiu-se um novo vetor de expressão no qual os TrpRS mutantes seriam expressos de forma constitutiva e uma segunda proteína, troponina C F29W, seria expressa de forma induzível. No entanto, não se observou incorporação do 1MW nestas proteínas. Ensaios de atividade in vitro, de formação de triptofano-hidroxamato e de intercâmbio de pirofosfato da TrpRS e mutantes indicaram uma baixa atividade dos mutantes utilizando triptofano como substrato. Os mutantes D135C e D135S apresentaram um considerável aumento (aproximadamente 24 vezes) na especificidade para 1MW em comparação ao Trp. A anotação do genoma da Xanthomonas indicou que a TrpRS deste organismo possui 88 aminoácidos extras na região C-terminal, o que é incomum para procariotos (somente observado em Xyllela e Pseudomonas). Clonou-se, expressou-se e purificou-se a TrpRS da Xanthomonas, com e sem os 88 aminoácidos extras. Observou-se atividade enzimática em ensaios de formação de triptofano-hidroxamato e intercâmbio de pirofosfato nas quais a TrpRS sem os 88 resíduos C-terminais apresentou uma atividade um pouco menor que a enzima tipo selvagem.
Titre en anglais
Modifications in the active site of tryptophan tRNATRP E. coli synthetase
Mots-clés en anglais
Escherichia coli (Change)
Molecular biology
Mutagenesis
Recombinant proteins
Resumé en anglais
Abstract not available.
 
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Date de Publication
2018-10-08
 
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