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Tesis Doctoral
DOI
10.11606/T.46.2002.tde-09092014-162645
Documento
Autor
Nombre completo
Aurea Denise de Sousa Soller Ferreira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2002
Director
Tribunal
Farah, Chuck Shaker (Presidente)
Ferreira, Sergio Teixeira
Schreier, Shirley
Sorenson, Martha Meriwether
Verjovski-Almeida, Sérgio
Título en portugués
Tropomiosinas contendo 5-hidroxitriptofano: sondas especificas para interações no filamento fino
Palabras clave en portugués
Actinas (Interação - Estudo)
Bioquímica orgânica
Proteínas musculares (Interação - Estudo)
Resumen en portugués
Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press).
Título en inglés
Tropomyosins containing 5-hydroxytryptophan: probes specific for interactions in thin filament
Palabras clave en inglés
Actins (Interaction - Study)
Muscle proteins (Interaction - Study)
Organic Biochemistry
Resumen en inglés
Tropomyosin (Tm) is a coiled-coil protein that polymerizes by head-totail interactions in an ionic-strength-dependent manner. In skeletal muscle,Tm interacts with troponin (Tn) to modulate muscle contraction via its Ca2+-dependent repositioning on the actin filament. Since residues 258-275 present a striated muscle-specific pattern atypical for a coiled-coil structure, we produced a total of 18 polymerizable (ASTm) and non-polymerizable (nfTm) versions of recombinant Tm with tryptophan analogues probes incorporated at specific positions near their C-termini. We found three mutants whose fluorescence are specifically sensitive to Tn-binding (position 263), actin-binding (261) or Tm polymerization (269). We used these mutants to: i) quantitatively investigate the ASTm monomer - polymer equilibrium and its dependence on ionic strength and determine a minimum number effective charges involved in stabilizing the head-to-tai/ interaction, ii) demonstrate that amino acid residue 263 of Tm interacts with residues 77-157 of TnT and that neighboring amino acid sequences along the primary structure of TnT modulate this interaction, iii) quantitatively analyze the binding of the ASTm mutants to Tn, in the presence and in the absence of actin and Ca2+; and iv) qualitatively investigate the influence of the head-to-tail overlap in Tm binding to actin and/or Tn.
 
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Fecha de Publicación
2014-09-09
 
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