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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.46.2010.tde-26042010-160643
Document
Author
Full name
Mirian Galliote Morale
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2009
Supervisor
Committee
Ho, Paulo Lee (President)
Chammas, Roger
Villa, Luisa Lina
Title in Portuguese
Desenvolvimento de vacina terapêutica contra HPV16
Keywords in Portuguese
Antígenos de vírus (Imunologia)
E6 e E7
HPV16
L1
Neoplasias do colo uterino
Oncoproteínas
Proteínas ( Isolamento e purificação)
Ubiquitina
Abstract in Portuguese
O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulheres no mundo. A maioria dos casos (83%) ocorre em países em desenvolvimento, onde são encontrados em estágios relativamente avançados e, conseqüentemente, a sobrevida média é de cerca de 49% após cinco anos. Portanto, uma vacina eficaz contra as infecções pelo HPV pode levar ao controle do câncer do colo do útero. Apesar de prevenir, a vacina profilática não é acessível em função do alto custo, além de não eliminar o vírus em mulheres já infectadas pelo HPV. Assim, propusemos o desenvolvimento de uma vacina terapêutica eficaz utilizando duas abordagens: VLPs (virus-like particles) quiméricas, que poderiam apresentar propriedades profiláticas e terapêuticas, obtidas da fusão das proteína L1 e E7; proteínas quiméricas obtidas a partir da fusão de epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com e sem ubiquitina. Após subclonagens, com a obtenção dos vetores pPICHOLI-L1ΔCE71-50 e pPICHOLI-L1ΔCE743-77, partiu-se para a indução da expressão das VLPs quiméricas em Pichia pastoris, das quais não foram detectadas expressão protéica. Realizaram-se inúmeras modificações no protocolo de indução. Mesmo após essas alterações não foi detectada nenhuma expressão das fusões L1ΔCE71-50 ou L1ΔCE743-77. Como alternativa de uma vacina terapêutica, nos propusemos a expressar em E. coli proteínas sintéticas originadas da fusão entre epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com ou sem Ubiquitina, visando aumentar a apresentação de peptídeos via MHC de classe I de modo a estimular a eliminação de células infectadas com HPV16, evitando e regredindo o desenvolvimento dessas células cancerosas. Com a proteína E6E7 solúvel e purificada, realizou-se um ensaio de imunização. Nesse experimento, 20% dos animais imunizados com a proteína E6E7 não apresentaram desenvolvimento de tumor após a inoculação de células TC1. Assim isso nos leva a crer que com o aumento da concentração de proteína e utilização de adjuvantes seria possível aumentar o número de animais resistentes ao desenvolvimento do tumor. Em um segundo experimento de imunização, comparamos as proteínas E6E7 e E6E7Ub, em duas concentrações, 15 e 40 µg, e também com ou sem o adjuvante whole cell pertussis (WCP). Independentemente da concentração e presença ou ausência de WCP, os grupos imunizados com E6E7Ub apresentaram proteção contra o tumor entre 80% e 100% dos camundongos, enquanto os grupos imunizados com E6E7 apresentaram proteção entre 0% e 25%. Esses resultados são promissores, ainda que preliminares, indicando um potencial de uso da proteína E6E7Ub como imunógeno para vacina terapêutica contra o câncer cervical induzido por HPV16
Title in English
Development of a therapeutic vaccine against HPV16
Keywords in English
HPV16
L1
Oncoproteins
Protein (Isolation and purification)
Ubiquitin
Uterine cervical neoplasms
Viral antigens (Immunology)
Abstract in English
Cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide. Most cases (83%) occur in developing countries, where they are found in relatively advanced stages and, consequently, the median survival is about 49% after five years. Therefore, an effective vaccine against HPV infections can lead to control of cancer of the cervix. Although preventable, the prophylactic HPV vaccine is not accessible to all due to their high cost and in addition the vaccine does not eliminate the HPV in infected women. We have therefore proposed the development of effective therapeutic vaccines using two approaches: chimeric VLPs (virus-like particles), endowed with prophylactic and therapeutic properties, obtained from the fusion protein L1 and E7; chimeric proteins derived from the fusion of epitopes of proteins E6 and E7 of HPV16 with and without ubiquitin. After subcloning, we obtained the vectors pPICHOLI-L1ΔCE71-50 and L1 pPICHOLI- L1ΔCE743-77. After transformation of yeast Pichia pastoris with these constructions, the cells were induced, but it was not possible to detect any recombinant protein expression. As an alternative, we proposed the expression of synthetic proteins in E. coli derived from the fusion between epitopes of E6 and E7 proteins of HPV16 with or without Ubiquitin, in order to enhance the presentation of peptides through MHC class I to stimulate the elimination of HPV16-infected cells, preventing and regressing the development of cancer cells. Soluble E6E7 protein was purified and, 20% of the animals immunized with this protein did not develop tumor after inoculation of TC1 cells. In a second immunization experiment we compared the proteins E6E7 and E6E7Ub, in two concentrations, 15 and 40µg, with or without the adjuvant whole cell pertussis (WCP). Regardless of concentration and presence or absence of WCP, all the groups immunized with E6E7Ub showed protection against tumor between 80% and 100%, while the groups immunized with E6E7 showed protection from 0% to 25%. These results are promising and although preliminary, indicate the potential of E6E7Ub protein as an immunogen, for a therapeutic vaccine against cervical cancer induced by HPV16
 
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Publishing Date
2010-05-17
 
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