Tese de Doutorado

Lipid metabolism plays a fundamental role in cellular homeostasis and immune responses, particularly during viral infections and oxidative stress. This thesis aims to explore lipid remodeling in the context of SARS-CoV-2 infection and the metabolic fate of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), using advanced mass spectrometry-based lipidomics and stable isotope tracing. The work is divided into four parts: the first provides the theoretical foundation, including a review of lipid alterations observed in COVID-19, lipid peroxidation and mediator biosynthesis, and the application of isotopically labeled lipids in metabolic studies. The remaining three chapters are structured in article format, presenting original research findings. The first experimental chapter investigates the incorporation of bis-allylic deuterated linoleic acid (D2-LA) into the lipidome of keratinocytes. Using high-resolution mass spectrometry, the study reveals preferential enrichment of D2-LA in mitochondrial membrane lipids, particularly cardiolipin and phosphatidylglycerol, suggesting a regulated remodeling process with potential implications for mitochondrial preservation. These findings also demonstrate the utility of untargeted lipidomics in tracing exogenous lipid incorporation at the molecular species level. The second chapter focuses on SARS-CoV-2-induced lipid remodeling in both in vitro (Calu-3 cells) and in vivo (golden Syrian hamster) models. Lipidomic analysis identified consistent increases in triacylglycerols (TG), cholesteryl esters (CE), and phosphatidylinositol (PI) species following infection. These changes reflect alterations in lipid droplet composition and membrane biosynthesis pathways likely supporting viral replication. Additionally, the accumulation of pro- inflammatory lipid mediators such as prostaglandins and thromboxane during early infection stages highlights the contribution of lipid signaling to the host immune response. The final chapter examines how the extracellular lipid environment and macrophage interactions influence oxylipin production and gene expression in Calu-3 cells. Co-culture with macrophages led to increased synthesis of 5-HETE and upregulation of cytochrome P450 enzymes (CYP1A1 and CYP1B1), even in the absence of infection. Furthermore, varying concentrations of exogenous arachidonic acid (AA) demonstrated that fatty acid availability modulates the profile of lipid mediators more strongly than SARS- CoV-2 infection alone under cell culture conditions. These findings underscore the importance of both the extracellular lipid milieu and immune cell interaction in shaping the lipid mediator landscape during inflammation. Overall, this thesis highlights the complexity and functional relevance of lipid remodeling in cellular responses to viral infection, exogenous fatty acids, and intercellular signaling, while showcasing the power of high-resolution lipidomics and stable isotope tracing in deciphering lipid metabolism.

O metabolismo lipídico desempenha um papel fundamental na homeostase celular e nas respostas imunes, particularmente durante infecções virais e estresse oxidativo. Esta tese tem como objetivo explorar a remodelação lipídica no contexto da infecção por SARS-CoV-2 e o destino metabólico dos ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), utilizando lipidômica avançada baseada em espectrometria de massas e rastreamento de isótopos estáveis. O trabalho está dividido em quatro partes: a primeira fornece a fundamentação teórica, incluindo uma revisão das alterações lipídicas observadas na COVID-19, peroxidação lipídica e biossíntese de mediadores, e a aplicação de lipídios marcados isotopicamente em estudos metabólicos. Os três capítulos restantes são estruturados em formato de artigo, apresentando resultados de pesquisa original. O primeiro capítulo experimental investiga a incorporação de ácido linoleico deuterado bis-alílico (D2-LA) no lipidoma de queratinócitos. Utilizando espectrometria de massas de alta resolução, o estudo revela o enriquecimento preferencial de D2-LA em lipídios da membrana mitocondrial, particularmente cardiolipina e fosfatidilglicerol, sugerindo um processo de remodelação regulado com potenciais implicações para a preservação mitocondrial. Essas descobertas também demonstram a utilidade da lipidômica não direcionada no rastreamento da incorporação de lipídios exógenos no nível de espécies moleculares. O segundo capítulo se concentra na remodelação lipídica induzida por SARS-CoV-2 em modelos in vitro (células Calu-3) e in vivo (hamster sírio dourado). A análise lipidômica identificou aumentos consistentes nas espécies de triacilgliceróis (TG), ésteres de colesterol (CE) e fosfatidilinositol (PI) após a infecção. Essas mudanças refletem alterações na composição das gotículas lipídicas e nas vias de biossíntese da membrana, provavelmente apoiando a replicação viral. Além disso, o acúmulo de mediadores lipídicos pró-inflamatórios, como prostaglandinas e tromboxano, durante os estágios iniciais da infecção, destaca a contribuição da sinalização lipídica para a resposta imune do hospedeiro. O capítulo final examina como o ambiente lipídico extracelular e as interações com macrófagos influenciam a produção de oxilipinas e a expressão gênica em células Calu-3. A co-cultura com macrófagos levou ao aumento da síntese de 5- HETE e à regulação positiva das enzimas do citocromo P450 (CYP1A1 e CYP1B1), mesmo na ausência de infecção. Além disso, concentrações variáveis de ácido araquidônico (AA) exógeno demonstraram que a disponibilidade de ácidos graxos modula o perfil de mediadores lipídicos de forma mais intensa do que a infecção por SARS-CoV-2 isoladamente em cultura celular. Esses achados ressaltam a importância tanto do ambiente lipídico extracelular quanto da interação das células imunes na formação do cenário de mediadores lipídicos durante a inflamação. De modo geral, esta tese destaca a complexidade e a relevância funcional da remodelação lipídica nas respostas celulares à infecção viral, ácidos graxos exógenos e sinalização intercelular, ao mesmo tempo em que demonstra o poder da lipidômica de alta resolução e do rastreamento de isótopos estáveis na decifração do metabolismo lipídico.