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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.46.2007.tde-30012008-134319
Document
Author
Full name
Leonor Magalhães Peres Galvão de Botton
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2007
Supervisor
Committee
Farah, Shaker Chuck (President)
Almeida, Fábio Ceneviva Lacerda de
Garratt, Richard Chales
Marana, Sandro Roberto
Miranda, Maria Teresa Machini de
Title in Portuguese
Estudos estruturais de proteínas de Xanthomonas axonopodis pv citri por ressonância magnética nuclear
Keywords in Portuguese
ClpS
Proteômica estrutural
Ressonância magnética nuclear
Xanthomonas axonopodis pv citri
Abstract in Portuguese
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado.
Title in English
Structural studies of Xanthomonas axonopodis pv citri proteins using nuclear magnetic resonance
Keywords in English
ClpS
Nuclear magnetic resonance
Structural proteomics
Xanthomonas axonopodis pv citri
Abstract in English
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.
 
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Publishing Date
2008-02-25
 
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