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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.46.2016.tde-17082016-081010
Document
Auteur
Nom complet
Raquel Mariano de Almeida
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2016
Directeur
Jury
Freire, Renato Sanches (Président)
Brito, Giancarlo Esposito de Souza
Corio, Paola
Costa, Jean Claudio Santos
Masini, Jorge Cesar
Titre en portugais
Estudo espectroscópico de anticorpos empregando-se superfícies SERS-ativas visando o desenvolvimento de imunossensores
Mots-clés en portugais
Anticorpos
Espectroscopia Raman
Fragmentos F(ab)'
Nanopartículas de ouro (NPAu)
SERS
Resumé en portugais
Este estudo empregou anticorpos que podem ser peças chaves no eventual desenvolvimento de imunossensores, devido as suas características de seletividade e consequente determinação de espécies de interesse em análises clínicas, ambiental, saúde publica, entre outros. Para isto, foram feitos estudos de espectros Raman e SERS de anticorpos inteiros e/ou fragmentados (IgG humana, anti-IgG humana (H+L) e anti-IgG humana (Fab2)). Com isto, foram conhecidos os principais modos vibracionais destas biomoléculas que são úteis para a proposta de se construir imunossensores. Ambas as técnicas fornecem informações a respeito da estrutura secundária de proteínas. Quando há a imobilização dessas biomoléculas sobre superfícies SERS-ativas, é possível determinar a sua orientação. Considerando-se que na técnica SERS existe a possibilidade de se detectar uma molécula, por meio de hot spots, é importante que as imunoglobulinas estejam sem impurezas como, por exemplo, a albumina e transferrina no caso de anticorpos provenientes do soro humano. Assim, foram feitos experimentos de purificação dos anticorpos por meio de colunas de afinidade contendo proteína A, G ou uma mistura de A e G imobilizadas e, também, separação baseada no ponto isoelétrico. Testou-se a capacidade de ligação (quimissorção) de IgG humana ou de seus fragmentos F(ab)' sobre superfícies de ouro por meio da técnica QCM-D. Para o estudo de superfícies SERS-ativas foram sintetizadas nanopartículas de ouro (NP-Au), com a aquisição de espectros de extinção no UV-Vis e obtenção de imagens MEV para caracterizá-las. Também, foram feitas variações no preparo de nanocubos de ouro (NC-Au) para obtenção de nanobastões de ouro (NB-Au), tendo-se em vista que estruturas com pontas favorecem a intensificação do sinal Raman em superfícies SERS-ativas. Por fim, considerando-se a existência de diversas ligações S-S, principalmente na região denominada dobradiça, no espectro SERS de IgGh diluída e do fragmento F(ab)' constatou-se o surgimento de uma banda característica de C-S em 679 cm-1. Por isso, foi feita uma proposta da possível orientação desses anticorpos não fragmentados para que assumissem uma orientação sobre as superfícies SERS-ativas com características semelhantes às dos fragmentos F(ab)'.
Titre en anglais
Spectroscopic study of antibodies employing SERS-active surfaces for the development of immunosensors
Mots-clés en anglais
F(ab) fragments
Gold nanoparticles (Au-NP)
Raman spectroscopy
SERS
Resumé en anglais
This study used antibodies that can be key elements in the possible evelopment of immunosensors, due to its selectivity and the consequent determination of species of interest in clinical analysis, environmental, public health, among others. For this, Raman and SERS spectra studies were made of whole and/or fragmented antibodies (human IgG, anti-human IgG (H + L) and anti-human IgG (Fab2)). With this, it were known the main vibrational modes of these biomolecules, useful for the proposal to assemble immunosensors. Both techniques provide information on the secondary structure of proteins. When these biomolecules are immobilized on SERS-active surfaces, it is possible to determine their orientation. Considering that, in the SERS technique, it is possible to detect a molecule through hot spots, it is important that the immunoglobulins are free of impurities, such as albumin and transferrin in the case of antibodies from human serum. Thus, purification experiments of antibodies were made via affinity columns containing protein A, G or a mixture of A and G immobilized and also separation based on isoelectric point. It was tested the binding capacity (chemisorption) of human IgG or its F(ab)' on gold surfaces by means of QCM-D technique. For the study of SERS-active surfaces of gold nanoparticles were synthesized (Au-NP), with the acquisition of extinction spectra in the UV-Vis and obtaining SEM images to characterize them. Also, changes were made in the preparation of nanocubes gold (Au-NC) to obtain gold nanorods (Au-NR), having in view that ends with structures favor the enhancement of Raman signal on SERS-active surfaces. Finally, considering the existence of various S-S links, particularly in the region called hinge, in the SERS spectrum of diluted hIgG and F(ab)', it was found the display of a characteristic band C-S 679 cm-1. Therefore, a proposal was made about the possible direction of these non-fragmented antibodies to assume an orientation on the SERS-active surfaces with similar characteristics to the F(ab)'
 
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Date de Publication
2016-11-16
 
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