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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.46.2012.tde-26042013-110017
Document
Author
Full name
Aline de Paula Vitor
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2012
Supervisor
Committee
Tavares, Marina Franco Maggi (President)
Cantu, Ana Valéria Colnaghi Simionato
Tavares, Marcelo de Sousa
Title in Portuguese
Determinação de aminoácidos por eletroforese capilar com detecção UV/vis para o estudo do perfil metabólico urinário do refluxo vésico-ureteral
Keywords in Portuguese
Aminoácidos
Biomarcadores
Eletroforese capilar
Metaboloma
Refluxo vésico-ureteral
Urina
Abstract in Portuguese
Uma avaliação da concentração dos aminoácidos primários em amostras de urina de crianças com refluxo vésico-ureteral (VUR) em busca de caminhos para o diagnóstico não invasivo desta doença. Dois métodos analíticos por eletroforese capilar com detecção UV/vis foram desenvolvidos para a quantificação dos analitos. No método 1 empregou-se a detecção UV/vis direta em 200 e 214 nm com as condições eletroforéticas eletrólito tampão fosfato 90 mmol L-1 pH 2,1; tensão de +15 kV; injeção de 7 s a 0,5 psi; capilar de 75 µm de diâmetro interno; 40,2 cm de comprimento total e 30,0 cm de comprimento efetivo. No método 2, fez-se uso da detecção indireta em 254 nm, com as condições eletroforéticas eletrólito tampão TEA 20 mmol L-1 e DNB 10 mmol L-1 pH 10,84; modificador de fluxo DDAB a 4 mmol L-1; tensão de -15 kV; injeção de 7 s a 0,5 psi; capilar de 75 µm de diâmetro interno; 50,2 cm de comprimento total e 40,0 cm de comprimento efetivo. O método 1 apresentou parâmetros de validação linearidade, precisão intra-dia e inter-dia, seletividade, robustez e recuperação satisfatórios. A quantificação de creatinina, fenilalanina (Phe), histidina (His), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) nas amostras de urina foi possível pelo método 1, porém inviável para quantificação de arginina (Arg). O método 2 apresentou valores de robustez e recuperação satisfatórios para os aminoácidos alanina (Ala), aspartato (Asp), glutamato (Glu) e glicina (Gly) satisfatórios, mas a quantificação dos mesmos na maioria das amostras de urina diluída não foi possível por estarem em nível de concentração abaixo da detecção ou quantificação. Para avaliar a potencialidade dos resultados como ferramenta no diagnóstico do VUR, os aminoácidos His, Phe, Trp e Tyr, quantificados em todas as amostras, foram empregados como variáveis na classificação das amostras em dois grupos distintos (1) grupo de crianças saudáveis e (2) grupo de crianças diagnosticadas com VUR. A classificação realizada pelo método de análise de componente principal (PCA) apresentou valores estatísticos satisfatórios e poder de predição: R2 (capacidade de ajuste) e Q2 (capacidade de predição) foram 0.9993 e 0.65, respectivamente com os dois componentes principais (PC1 e PC2). A separação total com valor de Q2 desejável (acima de 0,8) poderia ser alcançada com uma quantidade maior de informação, sendo neste caso, número maior de aminoácidos quantificados. Assim, este trabalho abre caminho para estudos mais aprofundados na investigação da concentração dos aminoácidos primários em pacientes com VUR, objetivando o desenvolvimento de um potencial biomarcador para VUR.
Title in English
Amino acids determination by capillary electrophoresis with UV/vis detection to vesicoureteral reflux urinary metabolic profiling
Keywords in English
Amino acids
Biomarker
Capillary electrophoresis
Metabolome
Urine
Vesicoureteral reflux
Abstract in English
An assessment of the concentration of primary amino acids in urine samples from children with vesicoureteral reflux (VUR) using capillary electrophoresis separation with UV/vis detection has been proposed to help establishing a means for non invasive diagnosis of the disease. Two analytical methods were developed. Method 1 used direct UV/vis detection at 200 and 214 nm, 90 mmol L-1 phosphate buffer at pH 2.1, high voltage separation at +15 kV, injection of 0.5 psi during 7 s, and a fused-silica capillary of 75 µm inner diameter, 40.2 cm total length, and 30.0 cm effective length. Method 2 used indirect UV/vis detection at 254 nm, TEA at 20 mmol L-1 and DNB at 10 mmol L-1 electrolyte at pH 10.84, 4 mmol L-1 DDAB as flow modifier, separation voltage at -15 kV, injection of 0,5 psi during 7 s, fused-silica capillary of 75 µm inner diameter, 50.2 cm total length, and 40,0 cm effective length. Method 1 presented satisfactory results for linearity, intra-day and inter-day precision, selectivity, robustness, and recovery. By method 1 it was possible to quantify creatinine, phenylalanine (Phe), histidine (His), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) but not arginine (Arg) in the urine samples under investigation. Method 2 presented satisfactory robustness and recovery for alanine (Ala), aspartate (Asp), glutamate (Glu) and glycine (Gly), but the contents of these metabolites in the urine samples were not established because they lay below the limits of detection and quantitation. To assess the potentiality of the results as diagnostic tool for VUR condition, the concentrations of the amino acids His, Phe, Trp and Tyr, quantified in all samples, were used as variables in a classification procedure where samples were divided in two distinct groups: (a) a group of healthy children and (b) a group of children diagnosed with VUR. The classification by principal component analysis (PCA) showed a partial separation with good statistics and prediction power: R2 (goodness of fit) and Q2 (goodness of prediction) were 0.9993 and 0.65, respectively with two components analysis (PC1 and PC2). Values of Q2 greater than 0.8 are usually desired and it could be provided if more information was available, such as a greater number of amino acids being quantified. Thus, this research opens the way for further investigative studies of amino acids concentration in patients with primary VUR, aimed at developing a potential biomarker for VUR.
 
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Publishing Date
2013-06-04
 
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