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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.5.2018.tde-03072018-090616
Document
Author
Full name
Tiphany Coralie de Bessa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2018
Supervisor
Committee
Laurindo, Francisco Rafael Martins (President)
Aiello, Vera Demarchi
Bassères, Daniela Sanchez
Dang, Pham My-chan
Kovacic, Hervé
Title in Portuguese
Mecanismo associados à  perda da regulação da nox1 NADPH oxidase pela dissulfeto isomerase proteica em células com ativação sustentada da via ras
Keywords in Portuguese
Espécies de oxigênio reativas
Estresse oxidativo
Inibidores da dissociação do nucleotídeo guaninarho-específica
Isomerase de dissulfetos de proteínas
NADPH oxidase
Neoplasias
Proteínas ras
Proto-oncogenes
Superóxidos
Abstract in Portuguese
Dissulfeto isomerase proteica como a PDIA1 tem sido implicada na progressão do câncer, porém os mecanismos envolvidos ainda não foram claramente identificados. Previamente, nós demonstramos um importante efeito da PDIA1 induzindo a superexpressão da Nox1 NADPH oxidase, associada à geração de espécie reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a perda na regulação de ROS envolve o crescimento tumoral, nós propusemos que a PDIA1 atua como um mecanismo regulador proximal na produção de ROS em tumores. No presente estudo, nós focamos no câncer colorretal (CRC) com distintos efeitos na ativação de KRas. Resultados provenientes de bancos de dados de RNAsec e validação direta, indicam um significante aumento na expressão de PDIA1 em CRC com alta ativação constitutiva da Kras (HCT116) vs. ativação intermediária (HKE3) ou basal (Caco2). A PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente da Nox1 em CRC; entretanto, observamos pela primeira vez uma ação dupla da PDIA1 correlacionada ao nível de ativação da Ras: em células Caco2 e HKE3, experimentos de perda de função indicam que o PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente de Nox1; no entanto, em células HCT116, PDIA1 limita a produção de superóxido pela Nox1. Este comportamento da PDIA1 é associado ao aumento da expressão / atividade da Rac1. A transfecção do mutante constitutivamente ativo Rac1G12V em células HKE3 faz com que a PDIA1 se torne restritiva a produção de superóxido dependente de Nox1, paralelamente, em células HCT116 tratadas com inibidor da Rac1, PDIA1 se torna favorável à produção de superóxido. Um screening em importantes vias de sinalização celular em HKE3 mostrou que a perda de função da PDIA1 promove inativação da GSK3? em paralelo à diminuicão da ativacção de Stat3; em HCT116 em estado basal, GSK3beta é inativada enquanto Stat3 está ativa, já o silenciamento da PDIA1 não resulta em nenhum efeito adicional. As implicações funcionais do silenciamento da PDIA1 incluíram uma diminuição da proliferação e migração celular em HKE3, não detectável em HCT116. Além disso, a PDIA1 parece sustentar a transição epitélio-mesenquimal (EMT), uma vez que após o silenciamento da PDIA1, observamos um aumento da expressão da E-caderina em HKE3 e uma diminuição em HCT116. Assim, a superativação da Ras se associa a uma alteração no padrão de regulação da Nox1 pela PDIA1. A supressão do efeito regulador da PDIA1 pela Kras é provavelmente devido a uma ativação sustentada da Rac1. Portanto, PDIA1 pode exercer um papel redox-dependente adaptativo crucial relacionado à progressão tumoral
Title in English
Mechanisms associated with loss of regulation of NADPH oxidase nox1 by protein disulfide isomerase in cells with sustained activation of the ras pathway
Keywords in English
NADPH oxidase
Neoplasms
Oxidative stress
Protein disulfide-isomerases
Proto-oncogenes
Ras proteins
Reactive oxygen species
Rho-specific guanine nucleotide dissociation inhibitors
Superoxides
Abstract in English
Protein disulfide isomerases such as PDIA1 have been implicated in cancer progression, but the underlying mechanisms are unclear. We showed previously important PDIA1 effects enabling vascular Nox1 NADPH oxidase expression and associated generation of reactive oxygen species (ROS). Since deregulated ROS production underlies tumor growth, we proposed that PDIA1 acts as an upstream regulatory mechanism of tumor-associated ROS production. We focused on colorectal cancer (CRC) with distinct levels of KRas activation. Our results from RNAseq databanks and direct validation indicate significant increase in PDIA1 expression in CRC with constitutive high (HCT116) vs. moderate (HKE3) or basal (e.g. Caco2) Ras activity. PDIA1 supported Nox1-dependent superoxide production in CRC; however, we observed for the first time a dual effect correlated with Ras level activity: in Caco2 and HKE3 cells, loss-of-function experiments indicate that PDIA1 sustains Nox1-dependent superoxide production; however, in HCT116 cells, PDIA1 restricted Nox1-dependent superoxide production. This PDIA1 behavior in HCT116 is associated with increased Rac1 expression/activity. Transfection of Rac1G12V active mutant into HKE3 cells induced PDIA1 to become restrictive of Nox1-dependent superoxide; accordingly, in HCT116 cells treated with Rac1 inhibitor, PDIA1 became supportive of superoxide production. Screening of cell signaling routes affected by PDIA1 silencing showed induced GSK3beta inactivation and parallel decrease of active Stat3 in HKE3 cells; in baseline HCT116 cells, GSK3beta was inactivated and Stat3 active, whereas PDIA1 silencing had no further effect. Functional implications of PDIA1 silencing included a decrease of cell proliferation and migration in HKE3, not detectable in HCT116 cells. Also, PDIA1 may support epithelial-mesenchymal transition (EMT), since after PDIA1 silencing, E-cadherin expression increased in HKE3 and decreased in HCT116. Thus, Ras overaction associates with a switched in PDIA1 pattern regulation of Nox1. Ras-induced PDIA1 bypass may involve direct Rac1 activation. Therefore, PDIA1 may be a crucial regulator of redox-dependent adaptive processes related to cancer progression
 
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Publishing Date
2018-07-03
 
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