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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.5.2016.tde-24022016-143836
Document
Author
Full name
Carla Luana Dinardo
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2015
Supervisor
Committee
Pereira, Alexandre da Costa (President)
Campos, Alexandre Holthausen
Spósito, Andrei Carvalho
Bortolotto, Luiz Aparecido
Title in Portuguese
Estudo das propriedades mecânicas das células de músculo liso vascular em situações fisiológicas e patológicas
Keywords in Portuguese
Artérias
Citoesqueleto
Citoesqueleto de actina
Músculo liso
Proteômica
Rigidez vascular
Tabagismo
Abstract in Portuguese
Introdução: As células do músculo liso vascular (CMLV) são quiescentes nos vasos adultos, com baixa capacidade de migração e de secreção de matriz extracelular, caracterizando fenótipo contrátil. Evidências apontam para a heterogeneidade fenotípica das CMLV ao longo da árvore arterial: há distribuição heterogênea de doenças e de resposta a determinadas drogas nos diferentes vasos, além de variabilidade de expressão dos genes de proteínas contráteis de músculo liso entre eles. O papel das CMLV, em fase adulta, é classicamente descrito como restrito à regulação do tônus de pequenos vasos, sendo insignificante a contribuição da mecânica das CMLV para a complacência das artérias elásticas. Existe a hipótese de que a viscoelasticidade das CMLV contribua para a mecânica final das artérias, sendo o enrijecimento dessas células associado à rigidez arterial. Objetivo: Estudar a variabilidade das propriedades mecânicas e de expressão proteica das CMLV, ao longo da árvore arterial, buscando identificar moduladores regionais para esse fenótipo. Avaliar se situações clínicas sabidamente associadas à rigidez arterial (envelhecimento, sexo feminino pós-menopausa, ancestralidade genética africana, diabetes mellitus e tabagismo) cursam com enrijecimento de CMLV. Métodos: 1) Estudou-se a composição e a organização da camada média de diferentes artérias. As CMLV desses vasos foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G), por meio do ensaio de Citometria Magnético Ótica de Oscilação e, quanto à expressão proteica global, usando cromatografia multidimensional e espectrometria de massas em tandem de alta resolução (Proteômica Shotgun). Os dados mecânicos obtidos foram correlacionados com as características da matriz extracelular (MEC) dos vasos de origem (porcentagem de elastina e quantidade de MEC). Em paralelo, foi realizado experimento de estiramento cíclico (10%/1Hz) das CMLV das diferentes artérias por 24 e 48h, seguido pela mensuração de rigidez de citoplasma. 2) Foram isoladas as CMLV de fragmentos de artéria mamária de 80 pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio, células essas que foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G, G' e G''). Elaborou-se modelo estatístico para avaliar se as variáveis clínicas idade, sexo feminino, ancestralidade africana, tabagismo e diabetes mellitus estavam associadas a alterações de mecânica celular. Resultados: 1) A viscoelasticidade das CMLV variou significativamente entre as artérias. As CMLV provenientes de artérias distais (artérias femoral e renal) mostraram-se significativamente mais rígidas que as CMLV de aorta torácica (p < 0,001). Identificou-se correlação negativa entre rigidez de CMLV e quantidade de MEC / elastina na camada média vascular. O regime de estiramento cíclico por 48h reduziu globalmente a rigidez das CMLV. As CMLV provenientes da aorta torácica expressaram maior quantidade de proteínas relacionadas com a estrutura e a organização do citoesqueleto em relação às CMLV da artéria femoral. 2) Constatou-se variabilidade interindividual de viscoelasticidade de CMLV e associação entre tabagismo e sexo feminino com enrijecimento de CMLV. Conclusões: As CMLV são heterogêneas quanto às propriedades mecânicas, à organização do citoesqueleto e à expressão proteica ao longo da árvore arterial, reforçando o conceito de plasticidade fenotípica das CMLV. A mecânica das CMLV é modulada pelas características da MEC e pela tensão circunferencial cíclica aplicada às paredes vasculares pelo fluxo sanguíneo. Mulheres pós-menopausa e tabagistas exibem enrijecimento de CMLV, sendo esse fato um provável contribuinte para a rigidez arterial associada a essas condições e um possível alvo terapêutico a ser avaliado futuramente
Title in English
Study of the mechanical properties of vascular smooth muscle cells under physiological and pathological situations
Keywords in English
Actin cytoskeleton
Arteries
Cytoskeleton
Proteomics
Smoking
Smooth muscle
Vascular stiffness
Abstract in English
Rational: Vascular smooth muscle cells (VSMC) lose their ability to migrate and secrete extracellular matrix (ECM) with the end of vascular development, condition known as contractile phenotype and reversible in the presence of vascular injury. There is evidence of heterogeneity of VSMC phenotype along arterial tree, as the distribution of diseases (atherosclerosis) and the response to drugs vary between different vessels, as well as the expression of smooth muscle-contractile protein genes. The role played by VSMC mechanics on determining large arteries' compliance was always considered irrelevant. It has been hypothesized that the VSMC mechanical properties are important for vascular mechanics, especially in the pathological scenario, where VSMC stiffening may be associated with arterial rigidity. Goals: Study the variation of VSMC mechanics and protein expression along arterial tree, identifying regional modulators of this phenotype. Evaluate if clinical situations associated with arterial rigidity (ageing, post-menopausal women, African ancestry, diabetes mellitus and smoking) concur with VSMC stiffening. Methods: 1) Different arteries were studied in terms of composition and organization of their media layer. VSMC isolated from these arteries were evaluated regarding cytoplasm viscoelasticity, measured using Optical Magnetic Twisting Cytometry Assay (OMTC), and protein expression, using two-dimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry (Shotgun Proteomics). Mechanical data were correlated with ECM characteristics (percentage of elastin and ECM amount) of the vessels of origin. In parallel, VSMC of different arteries were subjected to cyclic stretching (10%/1Hz) during 24 and 48h, followed by the measurement of their cytoplasm rigidity. 2) VSMC were isolated from fragments of mammary artery of 80 patients subjected to coronary bypass surgery and evaluated regarding their viscoelasticity (G, G' e G''). A statistic model was elaborated to address if the clinical variables age, female sex, African ancestry, smoking and diabetes mellitus were associated with changes of VSMC mechanics. Results: 1) VSMC viscoelasticity varied significantly amongst the studied arteries. VSMC from heart-distant arteries (femoral and renal arteries) were stiffer than VSMC from thoracic aorta (p < 0,001). There was a negative correlation between VSMC rigidity and the amount of ECM / percentage of elastin within the media layer. 48h-cyclic stretching was associated with a global reduction of VSMC rigidity. VSMC of thoracic aorta expressed significantly more proteins associated with cytoskeleton structure and organization than VSMC of femoral artery. 2) There was a significant inter-individual variation of VSMC viscoelasticity. Smoking and female sex were associated with VSMC stiffening. Conclusion: VSMC mechanics, cytoskeleton organization and protein expression are heterogeneous along arterial tree. VSMC mechanical properties are modulated by ECM characteristics and by regional mechanical forces. This reinforces the concept of phenotypic heterogeneity of VSMC. Post-menopausal women and smokers exhibit stiffer VSMC, representing an important factor for the understanding of the arterial rigidity associated with these conditions and also a possible future therapeutic target
 
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CarlaLuanaDinardo.pdf (12.23 Mbytes)
Publishing Date
2016-02-25
 
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