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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.5.2009.tde-28082009-101052
Document
Auteur
Nom complet
Antonio Marcus de Andrade Paes
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2009
Directeur
Jury
Laurindo, Francisco Rafael Martins (Président)
Carboni, Beatriz Simonsen Stolf
Goto, Hiro
Lopes, Lucia Rossetti
Miyakawa, Ayumi Aurea
Titre en portugais
Mecanismo da interação entre a proteína dissulfeto isomerase e a NADPH oxidase: papel regulatório sobre a produção de espécies reativas de oxigênio em fagócitos profissionais
Mots-clés en portugais
Espécies de oxigênio reativas
Explosão respiratória
Fagócitos
Isomerase de dissulfeto da proteína
NADPH oxidase
Resumé en portugais
INTRODUÇÃO: A ativação da NADPH oxidase de neutrófilos requer o acoplamento das subunidades citosólicas p47phox, p67phox, p40phox e Rac2 ao componente de membrana citocromo b558. Em trabalhos anteriores, nós mostramos que as isoformas vasculares da oxidase são reguladas pela proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona redox. Neste trabalho, nós utilizamos um sistema cellfree semirecombinante como ferramenta para investigar o papel da PDI na ativação da NADPH oxidase do neutrófilo. RESULTADOS: Inibidores da PDI, scrambled RNAse (100g/mL) ou bacitracina (1mM), praticamente suprimiram a geração de superóxido. Para avaliação dos efeitos do estado redox da PDI sobre a atividade da oxidase, amostras de PDI foram previamente oxidadas (H2O2; 0,5 mM) ou reduzidas (DTT; 0,5 mM). A PDI oxidada (100 nM) aumentou a produção de superóxido em aproximadamente 30%, enquanto a mesma concentração de PDI reduzida promoveu efeito inverso, inibindo a atividade do complexo. A adição de um peptídeo contendo a seqüência peptídica do sítio ativo da PDI inibiu a produção de superóxido em 70%. Dados de imunolocalização e colocalização demonstraram que a interação da PDI com a subunidade p47phox parece ser intensificada pelo estímulo com PMA e envolvem modificações do estado redox de ambas as proteínas. CONCLUSÕES: Nossos dados confirmam a associação física e funcional entre a PDI e o complexo NADPH oxidase. Além disso, sugerem que a PDI exerça um importante papel como fator de regulação redox da ativação da oxidase.
Titre en anglais
Mechanisms involved in the interaction of protein disulfide isomerase with NADPH oxidase: regulatory role on the reactive oxygen species generation by professional phagocytes
Mots-clés en anglais
NADPH oxidase
Phagocytes
Protein disulfide isomerase
Reactive oxygen species
Respiratory burst
Resumé en anglais
Activation of the leukocyte NADPH oxidase requires the assembly of the cytosolic subunits p47phox, p67phox and p40phox and Rac2 with the membranebound cytochrome b558. We have previously shown that the vascular oxidase is regulated by the redox chaperone protein disulfide isomerase (PDI). Taking advantage of the semirecombinant cellfree system, we sought to investigate the role of PDI in the activation of neutrophil NADPH oxidase. The PDI thiol inhibitors scrambled RNase (100g/mL) or bacitracin (1mM), almost suppressed superoxide generation. In order to investigate if the redox status of PDI thiols could modulate superoxide generation, PDI was oxidized or reduced by treatment with H2O2 (0.5mM) or DTT (1mM), respectively. Oxidized PDI increased by 30% superoxide production, while reduced PDI diminished superoxide generation also in 30%. The addition of a peptide (1M) containing PDI´s exact active site sequence inhibited superoxide production by 70 %. Immuno and colocalization data demonstrated the interaction of PDI with the subunit p47phox to be intensified by PMA stimulation and to involve redox status exchange of both proteins. Our data confirm the physical and functional association between PDI and the oxidase complex. Moreover, we show a relevant role for PDI as a redoxdependent supportive factor for NADPH oxidase activation.
 
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antoniomapaes.pdf (3.00 Mbytes)
Date de Publication
2009-08-28
 
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