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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.5.2011.tde-23032011-184104
Document
Author
Full name
Sarah Desirée Barbosa Cavalcanti
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2011
Supervisor
Committee
Negro, Gilda Maria Barbaro Del (President)
Gompertz, Olga Fischman
Sette, Lara Durães
Title in Portuguese
Aplicação de metodologias de preservação e caracterização de fungos na coleção de culturas do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo
Keywords in Portuguese
Coleção de culturas
Fenótipo
Fungos
Preservação biológica/métodos
Sequencia de DNA
Taxonomia
Abstract in Portuguese
A coleção de fungos do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo/USP compreende 1047 isolados de fungos, algas e actinomicetos de interesse médico e veterinário, que até o início deste estudo eram mantidos sob repiques sucessivos a cada três meses. Criada em 1925 pelo Prof. Dr. Floriano Paulo de Almeida e, a partir de 1953, mantida pelo Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz, a coleção necessitava de adequação de seu espaço físico e atualização nos métodos de preservação dos isolados. A reforma física foi realizada de acordo com as normas de biossegurança recomendadas pelo manual de procedimentos para manipulação de patógenos. Diversos estudos têm demonstrado que repiques sucessivos propiciam alterações nas características morfológicas, antigênicas, genéticas e de virulência de isolados fúngicos. Deste modo, foram aplicadas metodologias de preservação de longo prazo, como: liofilização, água destilada esterilizada, congelamento a -80ºC e em nitrogênio líquido (-196ºC). Foram selecionados 386 isolados, entre fungos dimórficos (213), filamentosos (hialinos e melanizados - 106) e leveduras (67), relacionados às infecções fúngicas mais prevalentes em nosso meio. Foram utilizados dois métodos de preservação para cada grupo de fungos: as leveduras foram submetidas à liofilização e congelamento em freezer -80ºC; e os fungos dimórficos e filamentosos preservados em água destilada esterilizada e no vapor de nitrogênio líquido. Esses isolados foram inicialmente avaliados quanto à caracterização morfológica e, após aplicação dos métodos de preservação, avaliou-se a viabilidade dos mesmos dentro de um período de dois anos, bem como a morfologia. As leveduras apresentaram 100% de viabilidade pelos dois métodos de preservação, mantendo suas características fenotípicas. Do mesmo modo, os dois métodos aplicados aos fungos filamentosos resultaram em elevados índices de viabilidade, com manutenção das características morfológicas. Em relação aos fungos dimórficos, a manutenção em nitrogênio líquido resultou em índices variáveis de viabilidade, dependendo do gênero avaliado. Do total de isolados do estudo, 75 foram submetidos também à identificação molecular por sequenciamento automatizado, após amplificação da região ITS do DNA ribossomal por PCR. A técnica molecular demonstrou, para alguns desses isolados, discordância na identificação das espécies quando comparada aos métodos fenotípicos. Os resultados deste estudo demonstraram que os repiques sucessivos não são recomendados para a preservação de fungos em coleções, por alterarem as características fenotípicas, bem como a capacidade de produzir esporos. As novas metodologias de preservação adotadas mantiveram a morfologia típica dos gêneros e espécies, permitindo ainda a viabilidade da maioria dos isolados estudados. A identificação molecular demonstrou ser importante ferramenta para autenticação dos isolados
Title in English
Application of preservation methods and characterization of fungal isolates from the Instituto de Medicina Tropical de São Paulo culture collection
Keywords in English
Biological preservation/methods
Culture collections
DNA sequence
Fungi
Phenotypic
Taxonomy
Abstract in English
The fungal culture collection from the Instituto de Medicina Tropical de São Paulo/USP comprises 1047 isolates of fungi, algae and actinomycetes with medical and veterinary relevance, which up to now have been preserved by subculturing every three months. Created in 1925 by Prof. Floriano Paulo de Almeida and maintained by Prof. Carlos da Silva Lacaz and his assistants since 1953, this fungal collection needed to be realocated to another area in 2007, as well as updated and revised as to its preservation methods. This new area was reformed according to safety procedures recommended in guidelines for pathogenic microorganisms manipulation. Several studies demonstrated that storage of fungi by subculturing may induce antigenic changes, phenotypic and genetic alterations, in addition to attenuation of virulence. The present study was aimed at utilizing more adequate methods of long-term preservation, such as lyophilization, sterile distilled water, and cryopreservation (freezing at -80°C and storage in liquid nitrogen [-196°C]). Three hundred eight six isolates consisting of dimorphic (213) and filamentous fungi (hyaline and melanized - 106), and yeasts (67) associated with the most prevalent fungal diseases in our setting were randomly selected. Two methods were applied for storage of each fungal group: yeasts were submitted to lyophilization and freezing at -80ºC; dimorphic and filamentous fungi were preserved in sterile distilled water and liquid nitrogen. All isolates were initially evaluated for their morphological features, submitted to the different methods of storage, and during a period of up to two years, reassessed for viability and morphological features. Yeasts showed 100% viability by the two applied preservation methods, maintaining their phenotypic characteristics. Similarly, the two methods applied to filamentous fungi resulted in high rates of viability, with maintenance of morphology. Regarding the dimorphic fungi, the preservation in liquid nitrogen resulted in variable rates of recovery, depending on the genus assessed. From all studied isolates, 75 were also submitted to molecular identification by sequencing after PCR amplification of the ITS region of the ribossomal DNA. This molecular technique showed, for some isolates, a lack of agreement in species identification when compared with the phenotypic methods. The new long-term storage methods used in the study preserved the typical genus and species morphology of the studied isolates, while resulting in high viability rates. The molecular identification proved to be an important tool for the authentication of isolates
 
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Publishing Date
2011-03-25
 
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