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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.5.2013.tde-24022014-161059
Document
Author
Full name
Dulce Sachiko Yamamoto de Figueiredo
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2013
Supervisor
Committee
Negro, Gilda Maria Barbaro Del (President)
Gompertz, Olga Fischman
Padovan, Ana Carolina Barbosa
Title in Portuguese
Identificação fenotípica e molecular, perfil de suscetibilidade aos antifúngicos e detecção de glucuronoxilomanana em isolados clínicos de Trichosporon
Keywords in Portuguese
Análise de sequência de DNA
Antifúngicos
Fatores de virulência
Fenótipo
Glucuronoxilomanana
Leveduras
Técnicas de tipagem micológica/métodos
Trichosporon
Abstract in Portuguese
Infecções invasivas por Trichosporon spp. ocorrem com maior frequência em pacientes neutropênicos, principalmente portadores de doenças hematológicas malignas, e estão associadas a elevados índices de mortalidade devido às dificuldades na identificação do patógeno e à resistência aos fármacos mais empregados na terapêutica antifúngica. A identificação das espécies de Trichosporon é importante tanto para estudos epidemiológicos, como para associar aspectos clínicos com as espécies causadoras das infecções. Além disso, auxilia no tratamento da enfermidade, uma vez que a suscetibilidades aos fármacos antifúngicos pode variar de acordo com a espécie. Além disso, as leveduras do gênero Trichosporon sintetizam a glucuronoxilomanana (GXM) em sua parede celular, que pode estar envolvida no mecanismo de virulência do patógeno. Este estudo teve como objetivo determinar, por identificação fenotípica e molecular, espécies isoladas de pacientes internados em unidades hospitalares, comparando os resultados obtidos por ambos os métodos; avaliar diferenças na distribuição dessas espécies em relação às formas invasivas e não invasivas da infecção; determinar o perfil de suscetibilidade dessas leveduras aos antifúngicos, empregando um método de micro-diluição de referência e um método comercial; e avaliar a presença de GXM na parede celular dos isolados. Foram avaliados 74 isolados obtidos de amostras clínicas de pacientes do Hospital das Clinicas da FMUSP e de outras unidades hospitalares do Estado de São Paulo, no período de 2003 a 2011. Dezenove amostras foram isoladas de sítios estéreis do organismo (infecções invasivas) e 55 foram isoladas de urina e cateter (isolados não invasivos). Para a identificação das espécies, os isolados foram submetidos a análises fenotípicas, que incluíram estudo macro e micromorfológico, provas fisiológicas e avaliação do perfil bioquímico por sistema automatizado VITEK 2. A identificação molecular foi realizada pelo sequenciamento das regiões IGS e D1/D2 do DNA ribossomal. O perfil de suscetibilidade dos 74 isolados foi analisado pelo método de micro-diluição EUCAST (referência) com os fármacos fluconazol (FCZ), itraconazol (ITZ), voriconazol (VCZ), cetoconazol (CTZ), anfotericina B (AMB) e 5-fluocitosina (5FC); e pelo método de micro-diluição comercial Sensititre YeastOne, com os mesmos fármacos empregados no EUCAST, acrescidos do posaconazol (POS) e caspofungina (CAS). Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), erros categórico e essencial, bem como outros parâmetros foram comparados entre os dois métodos. A presença de GXM na parede celular dos 74 isolados foi determinada por citometria de fluxo, empregando anticorpo monoclonal anti-GXM. Os resultados dos estudos morfológicos e fisiológicos foram insuficientes para definir as espécies dos 74 isolados. Pela assimilação de carboidratos analisada pelo sistema VITEK 2, verificou-se que 71 isolados foram identificados como T. asahii (17 de infecção invasiva e 54 não invasivos), um isolado como T. mucoides (invasivo), e para dois isolados (um invasivo e um não invasivo), a identificação não foi conclusiva. Para estes últimos foi realizado o auxanograma (método manual), e a identificação permaneceu inconclusiva, pois pelo perfil de assimilação, os isolados poderiam ser identificados como T. asahii ou T. faecale. Pela técnica de sequenciamento, 62 dos 74 isolados foram identificados como T. asahii, demonstrando 82,4% de concordância com o sistema VITEK 2. Onze isolados com identificações discordantes pertenciam às espécies T. inkin (8), T. faecale (2) e T. dermatis (1), como determinado por sequenciamento. Dos dois isolados com identificação inconclusiva pelo VITEK 2, um foi identificado pela técnica molecular como T. asahii, enquanto para o outro isolado não foi possível definir a espécie. Portanto, dos 74 isolados do estudo, 62 foram identificados como T. asahii, 8 como T. inkin, 2 como T. faecale e 1 T. dermatis; dois isolados permaneceram sem identificação conclusiva. Os resultados dos testes de suscetibilidade in vitro mostraram que, em ambos os métodos, VCZ apresentou a melhor atividade antifúngica. Pelo método EUCAST, foram obtidos valores elevados de CIM para AMB, enquanto o mesmo não foi observado no teste comercial. Neste último, foram observados valores elevados de CIM para FCZ, POS e CAS. Em relação à 5FC, os valores de CIM 90% por ambos os testes foram elevados (16mg/L). Diferenças significantes foram observadas entre os valores de CIM obtidas pelos dois métodos, e percentuais relativamente elevados de erros categóricos graves quando o método comercial foi comparado ao de referência. Não houve diferença estatística significante de valores de CIM entre isolados de infecção invasiva e não invasiva, exceto para ITZ e 5FC. Cerca de 30% dos isolados obtidos de casos de infecção invasiva e não invasivos apresentaram resistência cruzada entre os azóis FCZ e VCZ, e uma pequena porcentagem apresentou multirresistência. Para a análise de GXM na parede celular dos 74 isolados do estudo, foi avaliada a intensidade de fluorescência emitida pela citometria de fluxo, não tendo sido observada diferença estatística significante entre isolados invasivos e não invasivos. O estudo permitiu concluir que T. asahii foi a espécie mais isolada das amostras clínicas obtidas de sítios estéreis e não estéreis. A metodologia clássica de identificação fenotípica não foi suficiente para definir as espécies do gênero Trichosporon, e o sistema VITEK 2 apresentou discordância quando comparado à técnica molecular para as espécies não T. asahii. Em relação aos testes de suscetibilidade in vitro, VCZ apresentou-se mais adequado para a inibição das leveduras, enquanto os fármacos AMB, FCZ e POS não foram eficazes para a maior parte dos isolados. As discordâncias encontradas entre o método de referência e o comercial sugerem que, para o segundo, são necessárias mais avaliações para seu emprego em rotina laboratorial para o gênero Trichosporon. A detecção de GXM não resultou em diferenças entre os isolados de ambos os grupos; no entanto, para se determinar o efeito protetor do polissacarídeo contra a ação de macrófagos, ensaios de fagocitose devem ser realizados
Title in English
Phenotypic and molecular identification, antifungal susceptibility profile, and glucuronoxylomannan detection in Trichosporon clinical isolates
Keywords in English
Antifungal agents
Glucuronoxylomannan
Mycological typing techniques/methods
Phenotype
Sequence analysis DNA
Trichosporon
Virulence factors
Yeasts
Abstract in English
Invasive Trichosporon spp. infections occur more frequently in neutropenic patients, especially those with hematologic malignancies, and are associated with high mortality rates due to difficulties in identifying the pathogen and treating patients with drugs most currently employed in antifungal therapy. Trichosporon species identification is important for epidemiological studies and to better define eventual species-specific clinical association. Additionally, antifungal susceptibility may vary according to the species. Furthermore, glucuronoxylomannan (GXM) is a cell wall-associated polysaccharide produced by genus Trichosporon, which may be involved in virulence mechanisms of this pathogen. This study aimed (i) to identify Trichosporon species isolated from hospitalized patients by both phenotypic and molecular methods, comparing results; (ii) to verify the distribution of these species in invasive and non-invasive infection episodes; (iii) to determine the in vitro activities of various antifungals agents against the Trichosporon spp. isolates, employing a reference micro-dilution method and a commercial system; (iv) and to analyze the surface expression of GXM. Seventy-four Trichosporon spp. isolates obtained from clinical specimens of patients admitted to the Hospital das Clínicas-FMUSP and to other hospitals in the state of São Paulo, from 2003 to 2011, were included in the study. Nineteen samples were isolated from sterile deep sites (invasive infections) and 55 were isolated from catheter and urine samples (non-invasive isolates). All isolates were submitted to phenotypic analysis, which consisted in morphological features observation, physiological tests and determination of the biochemical profile by VITEK 2 system. Molecular identification was performed by sequencing of IGS1 and D1/D2 regions from the ribosomal DNA. The susceptibility antifungal profiles of the 74 isolates were analyzed by both the EUCAST micro-dilution method (reference) employing fluconazole (FCZ), itraconazole (ITZ), voriconazole (VCZ), ketoconazole (CTZ), amphotericin B (AMB) and 5 - flucytosine (5FC), and the commercial micro-dilution test Sensititre YeastOne, with the same drugs employed in EUCAST plus posaconazole (POS) and caspofungin (CAS). The minimum inhibitory concentration values (MIC), categorical and essential errors as well as other susceptibility parameters were compared between both methods. The cell wall expression of GXM of all isolates was measured by flow cytometry employing an anti-GXM monoclonal antibody. The morphological and physiological features of the Trichosporon spp. isolates were insufficientto define species. The carbohydrate assimilation analysis, performed by VITEK 2 system, has resulted in 71 isolates identified as T. asahii (17 from invasive infections and 54 non-invasive isolates) and one isolate as T. mucoides (invasive). The species identification for the two remaining isolates (one invasive and one non-invasive) was inconclusive. For this reason, a manual auxanogram was performed with these isolates, resulting again in non-conclusive species identification. By the automated sequencing method, 62 of the 74 isolates were identified as T. asahii, showing 82.4% of agreement with the VITEK 2 identification. Eleven isolates were identified by sequencing as T. inkin (8), T. faecale (2) and T. dermatis (1), showing disagreement identification with the VITEK 2 system. Regarding the two isolates with inconclusive results by the carbohydrate assimilation, the molecular technique identified one as T. asahii, whereas for the other isolate the sequencing was also unable to define species. Therefore, among the 74 studied isolates, 62 were identified as T. asahii, eight as T. inkin, two as T. faecale and one as T. dermatis; and two isolates remained with unconclusive identification. Almost all Trichosporon spp. isolates displayed susceptibility to VCZ with both methods. By the EUCAST method, high values of MIC were observed for AMB, while by the commercial test especially the invasive isolates showed susceptibility to this drug. Additionally, the Sensititre kit provided elevated MIC values for FCZ, POS and CAS. In regards to 5FC, the MIC 90% values were consistently high (16 mg/L) in both methodologies. The MIC values obtained by both EUCAST and commercial methods were compared, resulting in significant differences of MIC values for all tested antifungal drugs; major categorical errors occurred at relatively high percentage with the commercial method. No statistically significant differences in MIC values were verified when invasive and non-invasive isolates were compared. Around 30% of both invasive and non-invasive isolates showed cross-resistance to FCZ and VCZ, while a small number of isolates was multiresistant. The GXM analysis by cytometry demonstrated no significant differences between invasive and non- invasive isolates. This study demonstrated that T. asahii was the most frequently isolated species from both deep and non-sterile sites of the patients. The classical phenotypic methodology was not able to define Trichosporon species, and the VITEK 2 system identification showed disagreement with the sequencing technique for the non-T. asahii species. Regarding the in vitro susceptibility tests, VCZ was the most effective drug against the isolates, whereas most of them appear to be less susceptible to AMB, FCZ and POS. The discrepancies in the Trichosporon spp. susceptibility results between the reference and commercial methods suggest that the latter requires further evaluation tests before it can be used in routine laboratory. Although the GXM expression seemed to be equal in both invasive and non-invasive Trichosporon spp. isolates, phagocytic assays should be performed in order to determine the protective effect of the polysaccharide against phagocytosis
 
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Publishing Date
2014-02-24
 
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