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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2020.tde-28012020-153501
Documento
Autor
Nome completo
Marcia Oliveira Casotti
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Santo, Maria Cristina Carvalho do Espírito (Presidente)
Segurado, Aluisio Augusto Cotrim
Pinto, Pedro Luiz Silva
Souza, Rogério de
Título em português
Diagnóstico da infecção de Biomphalaria glabrata por Schistosoma mansoni em área de baixa endemicidade no Estado de São Paulo, utilizando técnicas de biologia molecular
Palavras-chave em português
Biomphalaria
Diagnóstico
Epidemiologia Molecular
Esquistossomose
Helmintos
Vigilância
Resumo em português
Aproximadamente 240 milhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo Schistosoma mansoni (S. mansoni). No Brasil, os principais objetivos do programa de controle da esquistossomose são os de reduzir a infecção humana em áreas endêmicas, e de conter sua expansão. O principal hospedeiro intermediário deste parasita é o caramujo Biomphalaria glabrata (B. glabrata). O diagnóstico convencional da infecção por S. mansoni em Biomphalaria feito rotineiramente é ineficaz mediante algumas condições. Assim, o objetivo desse estudo foi desenvolver e padronizar técnicas moleculares sensíveis e específicas para detectar a infecção por S. mansoni em caramujos B. glabrata procedentes de uma área de baixa endemicidade (Ourinhos/SP). Moluscos de Ourinhos/SP foram adequadamente transportados para o Laboratório de Imunopatologia da Esquistossomose da Universidade de São Paulo (LIM-06), que já mantinha rotineiramente moluscos B. glabrata, linhagem BH. Foram testados protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase convencional (cPCR) e TaqMan®Reação em Cadeia da Polimerase (TaqMan®qPCR) para o diagnóstico da infecção no molusco. Dois grupos com 10 caramujos por linhagem (BH e Ourinhos) foram expostos a crescentes cargas parasitárias (1, 5, 10, 20, 30 miracídios) de S. mansoni (BH) e avaliados em dois períodos diferentes do ciclo assexuado: 72 horas e 14 dias após exposição. A extração de DNA de S. mansoni (BH) foi realizada em tecido da região cefalopodal dos caramujos utilizando o QiAmp®DNA MiniKit (Qiagen). O DNA extraído foi quantificado em Nanodrop®. Para amplificação, utilizou-se três primers sendo as sequências 28S do DNAr (cPCR), COX 1 do DNAmt e sequência de repetição em tandem (TaqMan®qPCR). A visualização dos produtos de amplificação do DNA na cPCR foi feita em gel de agarose 2%, na TaqMan®qPCR os dados foram interpretados com valores expressos em Ct (Cycle Threshold). Realizou-se a inoculação de hamsters com cercárias oriundas de B. glabrata (Ourinhos/SP) infectados com miracídios BH. Observamos os seguintes resultados: implantação da linhagem laboratorial de B. glabrata (Ourinhos/SP); Presença de bandas nítidas com 350 pb na reação de cPCR, além de produtos de amplificação do DNA de S. mansoni na TaqMan®qPCR expressos em Ct (Cycle Threshold). Essa positividade foi observada em ambos os períodos pós-exposição nos dois métodos moleculares empregados. A presença de alterações anatomopatológicas no hamster infectado, demonstra a capacidade que esse molusco tem de completar seu ciclo infeccioso. Os resultados demonstram que, mesmo em condições de restrição experimental, esse molusco foi capaz de se reproduzir e manter um novo ciclo laboratorial de uma nova linhagem B. glabrata (Ourinhos/SP). Além disso, as técnicas moleculares foram sensíveis na detecção do DNA dos moluscos Ourinhos infectados pelo S. mansoni cepa BH. Portanto, é um estudo que poderá promover o monitoramento e a gestão das coleções hídricas nas áreas de baixa endemicidade melhorando o impacto dessa parasitose na qualidade de vida dessas populações
Título em inglês
Diagnose of Schistosoma mansoni infection of Biomphalaria glabrata in an area of low endemicity in the State of São Paulo using molecular biology techniques
Palavras-chave em inglês
Biomphalaria
Diagnosis
Helminths
Molecular epidemiology
Schistosomiasis
Surveillance
Resumo em inglês
Approximately 240 million people worldwide are infected with Schistosoma mansoni (S. mansoni). In Brazil, the main objectives of the schistosomiasis control program are to reduce human infection in endemic areas, and to restrain its expansion. The main intermediate host of this parasite is the snail Biomphalaria glabrata (B. glabrata). The conventional diagnosis of S. mansoni infection in Biomphalaria is routinely inappropriate under some conditions. The objective of this study was to develop and standardize sensitive and specific molecular techniques to detect S. mansoni infection in B. glabrata snails from an area of low endemicity (Ourinhos/SP). Molluscs from Ourinhos/SP were adequately transported to the Laboratory of Immunopathology of Schistosomiasis in University of São Paulo (LIM-06), which already routinely kept B. glabrata molluscs, BH lineage. Conventional Polymerase Chain Reaction (cPCR) protocols and TaqMan® Polymerase Chain Reaction (qPCR TaqMan®) were tested for molluscum infection diagnosis. Two groups of 10 snails per lineage (BH and Ourinhos) were exposed to increasing parasitic loads (1, 5, 10, 20, 30 miracides) of S. mansoni (BH) and evaluated in two different periods of the asexual cycle: 72 hours and 14 days after exposure. Extraction of S. mansoni (BH) DNA was performed on cephalopodal region tissue of snails using QiAmp DNA MiniKit® (Qiagen). The extracted DNA was quantified in Nanodrop®. For amplification, three primers of the 28S rDNA sequences (cPCR), COX 1 from mtDNA and tandem repeat (qPCR TaqMan®) were used. Visualization of the DNA amplification products in the cPCR was done on 2% agarose gel, in TaqMan® qPCR the data were interpreted with values expressed in Ct (Cycle Threshold). In addition, hamsters were inoculated with cercáriae from B. glabrata Ourinhos/SP infected with BH miracidea. We observed the following results: implantation of the laboratory lineage of B. glabrata Ourinhos/SP; presence of clear bands with 350 bp in the cPCR reaction, in addition to amplification products of S. mansoni DNA in TaqMan® qPCR expressed in Ct (Cycle Threshold). This positivity was observed in both postexposure periods of the two molecular methods employed. The presence of anatomopathological changes in infected hamsters demonstrates that, even under conditions of experimental restriction, this mollusk was able to reproduce and maintain a new laboratory cycle of a new lineage, and completimg the asexual cycle in the intermediate host and the sexual cycle in the final host B. glabrata (Ourinhos/SP). Thus, molecular techniques were sensitive and specific in detection of the DNA from molluscs Ourinhos/SP infected by S. mansoni strain BH. Positivity of both molecular methods anticipate the diagnosis of molluscum when compared to traditional methods. Therefore, it is a study, which increases pre-patent diagnostic stage of infection, and can promote the monitoring and management of water collections in low endemic areas, improving the impact of this parasite on the quality of life of these populations
 
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Data de Publicação
2020-01-28
 
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