Produtos de glicação avançada (AGE) induzem estresse inflamatório por intermédio da ativação do fator nuclear NF-kappa-B (NFKB), mediante ligação ao receptor para AGE (RAGE). A sinalização do RAGE converge com a do receptor 4 do tipo toll (TLR4) e os AGE sensibilizam macrófagos à estimulação inflamatória por lipopolissacarídeos (LPS). Este efeito é sustentado em macrófagos, persistindo mesmo após longo tempo em meio isento de AGE e são dependentes do controle glicêmico em indivíduos com diabetes mellitus (DM). Testou-se a hipótese de que a persistência da ação da albumina-AGE seja decorrente da ativação nuclear sustentada de NFKB. Sendo assim, determinou-se em macrófagos, tratados com albumina controle (C) e albumina-AGE, o tempo de persistência da sensibilização à estimulação inflamatória por LPS inferido pela 1) secreção de citocinas inflamatórias; 2) conteúdo nuclear das subunidades de NFKB, p50 e p65; 3) expressão de genes inflamatórios. A albumina-AGE foi preparada in vitro pela incubação com glicolaldeído 10mM, durante 4 dias a 37ºC, no escuro e a albumina-C, incubada apenas com solução tampão-fosfato. Macrófagos da linhagem RAW-264.7 sobrecarregados, por 24h com lipoproteínas de densidade baixa (LDL) acetilada, foram tratados com albumina-C ou AGE (2 mg/mL, 48 h), na presença ou ausência de HDL. A seguir, foram mantidos em meio isento dessas albuminas por diferentes intervalos de tempo e, posteriormente, incubadas por 24 h com LPS. Foram determinadas a expressão gênica de RelA, Nfkb1, Ager, Tlr4, IL6, TNF, Abca1 e Abcg1 por RT-qPCR, o conteúdo nuclear de p50 e p65 por Western blot e a secreção de citocinas inflamatórias TNF, IL-6 e IL-1beta, por ELISA. As comparações foram feitas por ANOVA de um fator ou teste t de Student (n=6). A albumina-AGE sensibilizou os macrófagos à estimulação por LPS, favorecendo maior secreção de TNF, IL-6 e IL-1 beta em, respectivamente, 1,5%, 9,4%, 5,6% em comparação à albumina-C (tempo zero). O aumento na secreção de TNF, IL-6 e IL-1beta permaneceu, respectivamente, até 24 h, 24 h e 12 h, mesmo após a remoção da albumina-AGE do meio, com uma área sob a curva maior em 1,6, 16 e 5,2 vezes, respectivamente; a incubação na presença de HDL não alterou o perfil inflamatório persistente. A expressão dos genes Il6 e RelA, (após 8 h da remoção das albuminas do meio de cultura) Il6 e Abca1 (após 24 h da remoção das albuminas do meio de cultura) foi maior nas células tratadas com albumina-AGE, em comparação à albumina-C. O conteúdo nuclear de p50 foi semelhante entre os grupos, mas o p65 permaneceu aumentado 2,9 vezes, por até 24 h, nas células tratadas com albumina-AGE em comparação à albumina-C. Os resultados evidenciam que a ativação prolongada da subunidade p65 do fator nuclear NF-kappa-B sustenta o efeito persistente dos AGE sobre alteração na expressão gênica e a secreção de citocinas inflamatórias em macrófagos desafiados com LPS, o que contribui para a memória metabólica celular

Advanced glycation end products (AGEs) elicit inflammation by triggering the activation of nuclear factor NF-kappa-B (NFKB) upon binding to the receptor for AGE (RAGE). Moreover, RAGE signaling converges with toll-like receptor 4 (TLR4) signaling, and AGEs prime macrophage to the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation. This effect is sustained in these cells, persisting even after a long time in an AGE-free environment, and depends on glycemic control in individuals with diabetes mellitus (DM). The persistence ofsensitization to inflammatory stimulation by LPS was determined in macrophages treated with control albumin (C) and AGE-albumin, inferred by 1) secretion of inflammatory cytokines; 2) nuclear content of NFKB subunits, p50, and p65; 3) expression of inflammatory genes. AGE-albumin was prepared by incubation with 10mM glycolaldehyde for 4 days at 37ºC in the dark, and C-albumin was incubated only with a phosphate-buffered solution. RAW-264.7 macrophages overloaded for 24h with acetylated low-density lipoprotein were treated with C or AGE-albumin (2 mg/mL, 48 h), in the presence or absence of HDL. They were then kept in a medium free of these albumins for different intervals and subsequently incubated for 24 h with LPS. Gene expression of RelA, Nfkb1, Ager, Tlr4, IL6, TNF, Abca1, and Abcg1 was determined by RT-qPCR, nuclear content of p50 and p65 by western blot, and secretion of inflammatory cytokines TNF, IL-6, and IL-1beta by ELISA. Comparisons were done by one-way ANOVA or Student t-test (n=6). AGE-albumin sensitized macrophages to LPS stimulation, favoring increased secretion of TNF, IL-6, and IL-1 beta by 1.5%, 9.4%, and 5.6%, respectively, compared to C-albumin (zero time). The increase in TNF, IL-6, and IL-1beta secretion persisted, respectively, up to 24 h, 24 h, and 12 h, even after the removal of AGE-albumin from the medium, with an area under the curve greater by 1.6, 16, and 5.2 times; incubation in the presence of HDL did not alter the persistent inflammatory profile. The expression of Il6 and RelA genes (after 8h of albumin removal from the culture medium) and Il6 and Abca1 (after 24 h of albumin removal from the culture medium) was higher in cells treated with AGE-albumin compared to C-albumin. The nuclear content of p50 was similar between groups, but p65 remained increased 2.9 times for up to 24 h in cells treated with AGE-albumin. The results demonstrate that prolonged activation of the p65 subunit of nuclear factor NFKB sustains the persistent effect of AGE on gene expression alterations and the secretion of inflammatory cytokines in LPS-challenged macrophages, contributing to cellular metabolic memory