Contexto: A síndrome de McCune-Albright (SMA) é uma doença rara caracterizada por displasia fibrosa óssea (DFO), manchas café-au-lait e hiperfunções endócrinas, causada por mutação ativadora pós-zigótica no códon 201 do gene GNAS, que codifica a subunidade alfa da proteína G estimulatória (Gs). As mutações missenses mais comuns (95% dos casos) decorrem da substituição de uma arginina por cisteína ou histidina (p.R201C/H). As mutações pós-zigóticas no gene GNAS são adquiridas em estágios precoces da embriogênese, resultando em um estado de mosaicismo somático. Devido a essa particularidade, o número de células afetadas varia dependendo do momento em que a mutação ocorre. Portanto, A SMA apresenta um amplo espectro fenotípico, que pode acarretar subdiagnóstico em quadros clínicos mais brandos. Consequentemente, técnicas que permitam a identificação da mutação no DNA de sangue periférico são altamente desejáveis, pois evitariam procedimentos invasivos para obtenção de amostras de tecidos, além da confirmação do defeito genético representar um grande avanço no diagnóstico, acompanhamento e manejo terapêutico dos pacientes portadores da SMA. Neste contexto, as técnicas de droplet digital PCR (ddPCR) e de sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE), emergiram como metodologias mais sensíveis para a identificação de mutações em mosaico. Objetivos: Pesquisar a mutação p.R201C/H no gene GNAS em DNA de leucócitos periféricos pela técnica de ddPCR. Comparar a técnica da ddPCR com o SPLE nos pacientes que foram submetidos ao painel de genes relacionados às endocrinopatias (que inclui o GNAS) da Disciplina de Endocrinologia da Faculdade de Medicina da USP ou sequenciamento exômico global (WES). Métodos: A caracterização clínica e genética de 64 pacientes foi realizada, sendo 53 pacientes de uma coorte brasileira e 11 pacientes de uma coorte espanhola. Foram incluídos pacientes com diagnóstico clínico da SMA (portadores de pelo duas características clínicas da SMA) e pacientes com 1 característica clínica da SMA (puberdade precoce periférica - PPP ou DFO). Todos os pacientes foram submetidos à análise genética por ddPCR e 35 dos 64 pacientes por SPLE. Resultados: A tríade clínica da SMA foi identificada em 34,4% (22/64) dos pacientes, enquanto 2 e 1 características clínicas estavam presentes em 34,4% (22/64) e 31,2% (20/64) dos pacientes, respectivamente. A PPP foi a endocrinopatia mais prevalente, presente em 59,4% dos pacientes. A ddPCR identificou a mutação p.R201C/H em 45,3 % (29/64) dos pacientes, sendo 25 pacientes portadores de SMA e 4 pacientes com 1 característica clínica (3 pacientes portadores de PPP e 1 de DFO). Houve associação entre o número das características clínicas e o resultado genético positivo (p=0,0154). A mediana da abundância fracional detectada na ddPCR foi 0,58 (IQ 0,16; 1,7), variando de 0,1% a 14,8%. Não houve diferença entre as medianas das taxas de abundância fracional e o número de manifestações clínicas da SMA (p=0,07). O SPLE identificou a mutação p.R201C/H em 20% (7/35) dos pacientes, todos portadores da SMA (6 pacientes portadores da tríade clínica e 1 paciente portador de 2 características clínicas). A média da abundância fracional das mutações foi 8,7 ± 6 % e variou entre 2,9% e 19%. Não houve associação entre o número de características clínicas e o resultado genético positivo (p=0,075). Houve diferença significativa na proporção de resultados positivos e negativos comparando a ddPCR com o SPLE (45,3% vs 20%, p=0,002). Não houve diferença entre as médias das taxas de abundância fracional e o tipo de teste genético realizado (p=0,34). Conclusões: A ddPCR representou o método mais sensível na confirmação do diagnóstico genético da SMA em DNA de sangue periférico. Quanto maior o número de manifestações clínicas da SMA, maior foi a probabilidade de estabelecer o diagnóstico genético da SMA. Houve concordância entre os resultados das amostras testadas pelas duas metodologias. O diagnóstico genético da SMA foi estabelecido pela ddPCR em pacientes com apenas uma manifestação clínica da síndrome (SMA-like)

Background: McCune-Albright Syndrome (MAS) is a rare disease characterized by bone fibrous dysplasia (FD), café-au-lait spots, and endocrine hyperfunctions. MAS is caused by a post-zygotic activating mutation in codon 201 of the GNAS gene, which encodes the alpha subunit of the stimulatory G protein (Gs). The most common missense mutations (95% of cases) result from the substitution of arginine with cysteine or histidine (p.R201C/H). Post-zygotic mutations in the GNAS gene are acquired in early stages of embryogenesis, resulting in a state of somatic mosaicism. Due to this particularity, the number of affected cells varies depending on when the mutation occurs. Therefore, MAS presents a broad phenotypic spectrum, which may result in underdiagnosis in milder clinical presentations. Consequently, techniques allowing the identification of the mutation in peripheral blood DNA are highly desirable, as they would avoid invasive procedures for obtaining tissue samples, and the confirmation of the genetic defect could represent a significant advance in the diagnosis, monitoring, and therapeutic management of MAS patients. In this context, droplet digital PCR (ddPCR) and next-generation sequencing (NGS) techniques have emerged as more sensitive methodologies for identifying mosaic mutations. Objectives: To investigate the p.R201C/H mutation in the GNAS gene in peripheral leukocyte DNA using the ddPCR technique. Compare the ddPCR technique with NGS in patients who underwent a panel of genes related to endocrinopathies (including GNAS) from the Discipline of Endocrinology at the Faculty of Medicine, University of São Paulo, or whole exome sequencing (WES). Methods: Clinical and genetic characterization of 64 patients was performed, including 53 patients from a Brazilian cohort and 11 patients from a Spanish cohort. Patients with a clinical diagnosis of MAS (having at least two clinical features of MAS) and patients with one clinical feature of MAS (peripheral precocious puberty-PPP or FD) were included. All patients underwent genetic analysis by ddPCR, and 35 of the 64 patients by NGS. Results: The clinical triad of MAS was identified in 34.4% (22/64) of patients, while 2 and 1 clinical features were present in 34.4% (22/64) and 31.2% (20/64) of patients, respectively. PPP was the most prevalent endocrinopathy, present in 59,4% of patients. DdPCR identified the p.R201C/H mutation in 45.3% (29/64) of patients, with 25 patients having MAS and 4 patients with one clinical feature (3 patients with PPP and 1 with FD). There was an association between the number of clinical features and positive genetic results (p=0.0154). The median fractional abundance detected in ddPCR was 0.58 (IQ 0.16; 1.7), ranging from 0.1% to 14.8%. There was no difference between the median fractional abundance rates and the number of MAS clinical manifestations (p=0.07). NGS identified the p.R201C/H mutation in 20% (7/35) of patients, all of whom had MAS (6 patients with the clinical triad and 1 patient with 2 clinical features). The mean fractional abundance of mutations was 8.7 ± 6%, ranging from 2.9% to 19%. There was no association between the number of clinical features and positive molecular results (p=0.075). There was a significant difference in the proportion of positive and negative results comparing ddPCR with NGS (p=0.002). There was no difference between the means of fractional abundance rates and the type of genetic test performed (p=0.34). Conclusions: ddPCR proved to be the most sensitive method in confirming the genetic diagnosis of MAS in peripheral blood DNA. The higher the number of clinical manifestations of MAS, the greater the likelihood of stablishing the genetic diagnosis of MAS. There was concordance between the results of samples tested by both methodologies. The genetic diagnosis of MAS was stablished by ddPCR in patients with only one clinical manifestation of the syndrome (SMA-like)