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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2019.tde-10122019-103713
Documento
Autor
Nombre completo
Adriana Martins Fernandes
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Souza, Bruno Ferraz de (Presidente)
Jorge, Alexander Augusto de Lima
Kim, Chong Ae
Oliveira, Telma Palomo de
Título en portugués
Diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita através do sequenciamento paralelo em larga escala de 15 genes candidatos
Palabras clave en portugués
Colágeno tipo I
Diagnóstico
Fraturas ósseas
Genética
Osteogênese imperfeita
Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala
Resumen en portugués
Osteogênese imperfeita (OI) é um conjunto de displasias esqueléticas hereditárias, heterogêneas dos pontos de vista clínico e genético. A maioria dos casos resulta de defeitos no colágeno tipo 1, entretanto diversos outros genes candidatos vêm sendo descritos. Não há definição de critérios mínimos para o diagnóstico clínico de OI, portanto o diagnóstico molecular vem permitir precisão diagnóstica, e melhor compreensão fisiopatológica e prognóstica. O objetivo deste estudo foi identificar o diagnóstico molecular da OI através da análise de genes candidatos por sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE), buscando-se associar características clínicas ao achado molecular. Para tanto, as regiões codificadoras e junções íntron-éxon dos 15 genes candidatos COL1A1, COL1A2, CRTAP, P3H1, PPIB, SERPINH1, FKBP10, PLOD2, BMP1, IFITM5, SERPINF1, WNT1, TMEM38B, SP7 e CREB3L1 foram capturadas e sequenciadas por SPLE na plataforma Illumina. Variantes genéticas raras (frequência alélica < 0,5%) com alto impacto sobre a proteína codificada foram confirmadas por sequenciamento Sanger e submetidas a análise de segregação familiar, quando possível. Variantes do número de cópias gênicas foram buscadas utilizando-se o software CONTRA e confirmadas por array citogenômico. Foram incluídos no estudo 49 indivíduos com OI, correspondendo a 30 casos isolados e 8 casos familiares, em sua maioria adultos (82%), com mediana de idade de 24 anos. O acometimento esquelético era leve em 37% dos indivíduos, moderado em 30% e grave em 33%. O SPLE foi realizado em todos os 49 pacientes da coorte, com cobertura média entre 354 a 1382 leituras, e superior a 50 em 99% das regiões-alvo. Identificou-se o diagnóstico molecular em 37 dos 38 casos (97%). Em 18 casos foram encontradas variantes em COL1A1 e em 9 casos em COL1A2, totalizando 71% dos casos com defeito no colágeno tipo 1. Variantes nos demais genes candidatos foram encontradas em 10 casos isolados: SERPINF1 (n=2), FKBP10 (n=2), PLOD2 (n=2), IFITM5 (n=1), P3H1 (n=1), TMEM38B (n=1) e WNT1 + P3H1 (n=1). Apenas uma variante de número de cópias foi encontrada (deleção dos éxons 1 e 2 de TMEM38B). Das 42 variantes encontradas, 23 já foram descritas anteriormente em associação a OI e 19 são variantes novas. As variantes em COL1A1 e COL1A2 (56% envolvendo troca de glicina) estão dispersas ao longo das proteínas e associadas a grande variabilidade fenotípica, como demonstrado pela variante COL1A2 p.(Gly772Ser) encontrada em três casos não relacionados com quadros clínicos diversos. Não foram encontradas variantes genéticas adicionais que pudessem explicar a variabilidade fenotípica. Variantes nos genes não colágenos estiveram associados a OI de maior gravidade (p=0,012), variantes em COL1A1 à manifestação de esclera azulada (p=0,009), e, dentre as variantes de COL1A1 e COL1A2, aquelas que resultaram em substituição de glicina estiveram associadas à dentinogênese imperfeita (p=0,003). Concluindo, este estudo demonstra que o diagnóstico molecular de OI por SPLE é eficaz. Frente à literatura, encontrou-se maior proporção de defeitos em genes não colágenos, que pode ser atribuída à gravidade dos pacientes incluídos ou a características da OI no Brasil, já que nossa população é pouco estudada do ponto de vista molecular. Espera-se que a precisão diagnóstica possibilitada pelo SPLE venha permitir tratamento e seguimento personalizados aos indivíduos com OI
Título en inglés
Molecular diagnosis of osteogenesis imperfecta through massively parallel sequencing of 15 candidate genes
Palabras clave en inglés
Diagnosis
Fractures bone
Genetics
High-throughput nucleotide sequencing
Osteogenesis imperfecta
Type I collagen
Resumen en inglés
Osteogenesis imperfecta (OI) is a clinically and genetically heterogeneous group of hereditary bone dysplasias. Even though most cases result from defects in type 1 collagen, several other candidate genes are arising. There is no definition of clinical criteria for the diagnosis of OI, hence the advent of molecular diagnosis may allow diagnostic precision, and better understanding of pathophysiology and prognosis. The objective of this study was to identify the molecular diagnosis of OI through the molecular analysis of candidate genes using massively parallel sequencing (MPS), and to associate clinical manifestations to the molecular findings. For these purposes, the coding regions and exon-intron boundaries of the 15 candidate genes COL1A1, COL1A2, CRTAP, P3H1, PPIB, SERPINH1, FKBP10, PLOD2, BMP1, IFITM5, SERPINF1, WNT1, TMEM38B, SP7 and CREB3L1 were captured and sequenced in the Illumina platform. Rare genetic variants (allelic frequency < 0.5%) impacting on the codified protein were confirmed by Sanger sequencing and submitted to segregation analysis when possible. Copy number variants (CNV) were sought using CONTRA and confirmed by SNP array. Forty-nine individuals with OI were included, corresponding to 30 sporadic and 8 familial cases, being mostly adults (82%) with a median of 24 years of age. OI was mild in 37% of individuals, moderate in 30% and severe in 33%. All 49 patients were analyzed by MPS, with mean coverage ranging from 354 to 1382 reads, and > 50 depth in 99% of target regions. A molecular diagnosis was obtained in 37 out of 38 cases (97%). COL1A1 variants were found in 18 cases, and COL1A2 variants in 9 cases, meaning that 71% of cases had type 1 collagen-related OI. Variants in the other candidate genes were found in 10 sporadic cases: SERPINF1 (n=2), FKBP10 (n=2), PLOD2 (n=2), IFITM5 (n=1), P3H1 (n=1), TMEM38B (n=1) and WNT1 + P3H1 (n=1). Only one CNV was found (deletion of exons 1 and 2 of TMEM38B). Among the 42 identified variants, 23 had already been reported in association to OI and 19 are novel variants. Identified COL1A1 and COL1A2 variants (56% glycine substitution) are scattered throughout the proteins, and associated to wide phenotypic variability, as demonstrated by the COL1A2 p.(Gly772Ser) variant found in three unrelated cases with different clinical presentations. Additional genetic variants that could help explain the phenotypic variability were not found. Variants in non-collagen genes were associated to severe OI (p=0.012), variants in COL1A1 to blue sclerae (p=0.009), and, amongst COL1A1 and COL1A2 variants, those resulting in glycine substitution were associated to dentinogenesis imperfecta (p=0.003). In conclusion, this study shows that the molecular diagnosis of OI through MPS is effective. In comparison to the literature, a higher proportion of non-collagen defects was found, which can be due to the OI severity of included patients or to a peculiarity of OI in Brazil, given that our population is underrepresented in molecular studies of OI. Hopefully, the diagnostic precision enabled by MPS will allow personalized treatment and follow-up of individuals with OI
 
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Fecha de Publicación
2019-12-10
 
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