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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2020.tde-09032020-100028
Documento
Autor
Nome completo
Alexandre Likier Steinberg Lobel
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Baracat, Edmund Chada (Presidente)
Izzo, Carlos Roberto
Podgaec, Sérgio
Zlotnik, Eduardo
Título em português
Efeitos da inibição da via PI3K/PTEN/Akt no recrutamento folicular após transplante de enxerto ovariano criopreservado
Palavras-chave em português
AS101
Ativação folicular
Preservação de fertilidade
Reserva folicular
Sinalização PI3K/PTEN/Akt
Transplante de tecido ovariano
Resumo em português
Introdução: A sinalização PI3K/PTEN/Akt é associada à ativação prematura e depleção da coorte folicular após quimioterapia e na isquemia após o transplante de tecido ovariano criopreservado. Este estudo tem como objetivo avaliar a ativação e a inibição da via PI3K/PTEN/Akt após o transplante de enxerto ovariano criopreservado, empregando a substância AS101,que reduziria a taxa de recrutamento folicular, e poderia diminuir o dano tecidual. Métodos: Estudo experimental com enxerto ovariano bovino em camundongas imunossuprimidas, dividido em cinco etapas: 1) análise da via PI3k/PTEN/Akt na ativação de folicular em tecido fresco, utilizando imunofluorescência; 2) comparação da atividade da via PI3K/PTEN/Akt entre tecido ovariano fresco não transplantado e tecido ovariano congelado, descongelado e transplantado, com retirada após cinco dias pela técnica de Western Blot; 3) incubação de tecido descongelado em duas horas com e sem AS101 e comparação por Western Blot; 4) comparação de tecidos fresco e descongelado, com e sem AS101, recuperados em dois e cinco dias após o transplante, por Western Blot e imunofluorescência; 5) avaliar a quantidade e os tipos de folículos no tecido ovariano descongelado, com e sem tratamento com AS101, em amostras recuperadas após 14 dias do transplante, por histomorfometria. Para tais experimentos foi utilizado tecido ovariano bovino obtido de animais pré-púberes (14 dias de vida), isolado e criopreservado por congelamento lento; tecido descongelado avaliado in vitro e in vivo, com e sem exposição ao AS101, em cultivo tecidual por duas horas antes do transplante. Os enxertos foram transplantados para os músculos glúteos de camundongas imunodeprimidas ooforectomizadas; a ativação da sinalização de Akt foi medida no tecido antes do transplante e em vários intervalos após o transplante. Após o procedimento, efetuou-se a contagem de folículos primordiais e em crescimento, bem como o cálculo da taxa de recrutamento folicular. As variáveis quantitativas foram estatisticamente analisadas com uso de testes de Mann-Whitney ou teste t-Student dados. A existência de associação das características qualitativas entre os grupos foi analisada com os testes de qui-quadrado ou exato de Fisher. O nível de significância foi fixado com alfa de 5%. Resultados: Os folículos primordiais, em estágio de quiescência apresentam baixa ativação da via PI3K/PTEN/Akt enquanto os folículos em crescimento, tinham maior taxa de atividade. Houve hiperatividade da via PI3K/PTEN/Akt, após o congelamento e o descongelamento do enxerto. A ministração de AS101 durante o cultivo in vitro reduziu o grau de ativação de PI3K/PTEN/Akt pelas técnicas de Western blot e imunofluorescência antes e após o transplante. Concomitantemente, houve aumento da reserva folicular após duas semanas do transplante e queda da taxa de recrutamento folicular. Conclusões: Nossos achados sugerem que o AS101 foi eficaz em preservar a reserva folicular, pelo recrutamento de folículos primordiais e inibição da via PI3K/PTEN/Akt. Contudo, há a necessidade de mais estudos clínicos para comprovar sua eficácia no tecido ovariano de mulheres
Título em inglês
Effects of PI3K/PTEN/Akt inhibition on follicular recruitment after cryopreserved ovarian graft transplantation
Palavras-chave em inglês
AS101
Fertility preservation
Follicular activation
Follicular reserve
Ovarian tissue transplantation
PI3K / PTEN / Akt Signaling
Resumo em inglês
Introduction: PI3K/PTEN/Akt signaling has been associated with premature activation and follicular cohort depletion in the context of chemotherapy and ischemia after cryopreserved ovarian tissue transplantation. This study aims to demonstrate that the PI3K/PTEN/Akt pathway is activated after retransplantation and that its inhibition, using substance AS101, may reduce the follicular recruitment rate. Methods: The study was divided into five experiments: Experiment 1 - Analysis of PI3K/PTEN/Akt pathway in follicular activation in fresh tissue, using immunofluorescence; Experiment 2 - Comparison of PI3K/PTEN/Akt pathway activity between fresh untransplanted ovarian tissue and frozen, thawed and transplanted ovarian tissue with removal after five days, using Western Blot; Experiment 3 - Two hour thawed tissue incubation with and without AS101, using Western blot comparison; Experiment 4 - Comparison of fresh and thawed tissues, with and without AS101, recovered two and five days after transplantation, using Western blot and immunofluorescence; Experiment 5 - Comparison of the number and type of follicles between thawed ovarian tissue, with and without AS101 treatment, in samples recovered 14 days after transplantation by histomorphometry. For these experiments, bovine ovarian tissue obtained from pre-pubertal animals (14 days old), isolated and slow frozen cryopreserved; thawed tissue evaluated in vitro and in vivo, with and without exposure to AS101, in tissue culture for two hours before transplantation; the grafts were transplanted to the gluteal muscles of oophorectomized immunosuppressed mice; Akt signaling activation was measured in tissue before transplantation and at various intervals after transplantation; After transplantation, primordial and growing follicle counts were performed, as well as calculation of follicular recruitment rate. Statistical analyzes were performed for quantitative variables using Mann-Whitney tests or Student t-tests, and the existence of an association of qualitative characteristics between the groups using chi-square or Fisher exact tests was verified. The tests were performed with a significance level of 5%. Results: It was initially demonstrated that primordial, quiescent stage follicles have low PI3K/PTEN/Akt pathway activation, while in growing follicles, the pathway is activated. The Akt pathway is overactivated after freezing, thawing and transplantation. Application of AS101 during in vitro culture reduced the degree of Akt activation demonstrated by Western blot and immunofluorescence, and increased follicular reserve after two weeks of transplantation, as well as reduced follicular recruitment rate. Conclusions: These findings showed that AS101 was capable of increasing follicular cohort as well as reducing activation and recruitment of primordial follicles. To determine relevance to a clinical setting, experiments should be reproduced using human ovarian tissue and long-term grafts should be followed to measure the functional output of the tissue in which Akt is inhibited
 
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Data de Publicação
2020-03-09
 
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