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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.5.2007.tde-20082007-141620
Document
Author
Full name
Elenice Messias do Nascimento Gonçalves
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2007
Supervisor
Committee
Corbett, Carlos Eduardo Pereira (President)
Azevedo Neto, Raymundo Soares de
Bello, Alexandre Ribeiro
Burattini, Marcelo Nascimento
Matte, Maria Helena
Title in Portuguese
Incidência de enteroparasitas com caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em diferentes comunidades brasileiras
Keywords in Portuguese
Cryptosporidium/classificação
Doenças parasitárias
Epidemiologia molecular
Reação em cadeia da polimerase
Abstract in Portuguese
O estudo foi desenvolvido com o intuito de detectar e caracterizar Cryptosporidium spp. em pacientes de diferentes comunidades brasileiras, atendidos no HC-FMUSP. A amostra utilizada foi de 2.410 amostras fecais, provenientes de exames realizados na Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC-HCFMUSP), no período de 2000 a 2006. A maioria das amostras (96,82%) era oriunda do Estado de São Paulo (DIR 1 a DIR 24), sendo que 56,18% eram do Município de São Paulo (DIR 1). Foi avaliada, também, sua relação com outros enteroparasitos, com dados clínicos e localização geográfica. Todas as amostras fecais foram submetidas a métodos de concentração para pesquisa de enteroparasitos, com resultado positivo de 4,6% e 27,8% para helmintos e protozoários, respectivamente. Oocistos de Cryptosporidium spp. foram detectados, por microscopia óptica após coloração pelo método de Kinyoun em 233 amostras fecais (9,7%), semi quantificados e medidos. A maioria das amostras apresentava pequena quantidade de oocistos. Nos isolados biológicos obtidos foi feito a extração do DNA genômico utilizando 223 amostras fecais preservadas a 20°C negativos, incubadas com solução de lise (Tris-HCl + EDTA + SDS 10% + beta mercaptoetanol + PVP) e proteinase K seguida de extração com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) em tubo Phase Lock Gel light . A amplificação do DNA alvo foi feita com PCR dupla, tendo como marcador genético o gene 18 SSUrRNA. Os produtos da amplificação (amplicons) da PCR - Dupla foram digeridos pelas enzimas de restrição: TaqI e AseI. A PCR dupla confirmou Cryptosporidium em 37,2% (83/223) das amostras fecais analisadas, com sua caracterização em 62,7% (52/83) após a digestão de seus produtos. Foram observados perfis característicos de C. hominis (88,5%), C. parvum (3,8%), Cryptosporidium não parvum não hominis (34,9%) e infecções mistas com C. hominis (27,2%). Os não caracterizados foram considerados Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. apresentou associações significativas com todos os grupos de riscos avaliados e diarréia. Foi observada correlação estatisticamente significativa entre tamanho dos oocistos detectados na microscopia e os genótipos Cryptosporidium hominis e Cryptosporidium não hominis não parvum. Conclui-se que diferentes genótipos de Cryptosporidium circulam em uma mesma região geográfica, infectando indivíduos tanto imunocompetentes como imunodeprimidos. A maior freqüência de Cryptosporidium hominis indica a rota fecal oral como a mais importante na transmissão desta infecção. Métodos moleculares de genotipagem são essenciais para estudos epidemiológicos deste organismo.
Title in English
Incidence of enteroparasites with molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different Brazilian communities
Keywords in English
Cryptosporidium/classification
Molecular epidemiology
Parasitic disease
Polymerase chain reaction
Abstract in English
The study was developed with the purpose to detect and characterize Cryptosporidium spp. in patients of different Brazilian communities attended at the HC-FMSUP. Fecal samples from 2,410 individuals were arise from the Central Laboratory Division of the University of São Paulo Medical School Hospital (DLC-HC-FMUSP) searching for enteroparasites, in the period from 2000 to 2006. Most samples (96.82%) were from São Paulo state (DIR 1 to DIR 4) of which 58.18% were from São Paulo city (DIR 1). Their relationship with other enteroparasites, clinical data and geographical localization was also assessed. In the search for enteroparasites, all fecal samples were submitted to concentration methods with a 4.6% and 27.8% positive result for helminths and protozoans, respectively. Cryptosporidium spp. oocysts were detected, semi-quantified and measured in 233 fecal samples (9.7%), using light microscopy after staining by Kinyoun's method. Most samples presented few oocysts. In the biologic isolates genomic DNA extraction was performed using 223 fecal samples stored at -20oC, incubated with lysing solution (Tris-HCl + EDTA + 10% SDS + ? mercaptoethanol + PVP) and proteinase K followed by extraction with phenol-chloroform-isoamylic alcohol in a Phase Lock Gel Light tube. Amplification of target DNA was performed with double PCR, with 18 SSUrRNA gene as genetic marker. The double PCR amplification products (amplicons) were digested by TaqI and AseI restriction enzymes. Double PCR confirmed Cryptosporidium in 37.2% (83/223) of the analyzed fecal samples with characterization in 62.7% (52/83) after digestion of its products. Characteristic profiles of C. hominis (88.5%). C. parvum (3.8%), Cryptosporidium non-parvum non-hominis (34.9%) and mixed infection with C. hominis (27.2%) were observed. Those not characterized were considered to be Cryptosporidium spp. Cryptopsoridium hominis presented significant associations with all evaluated risk groups and diarrhea. A statistically significant correlation between size of the oocysts detected by microscopy and the Cryptosporidium hominis and Cryptosporidium non-hominis non-parvum genotypes was observed. It is concluded that different Cryptosporidium genotypes circulate in the same geographical region, infecting both immunocompetent and immunodepressed individuals. The higher frequency of Cryptosporidium hominis indicates the fecal-oral pathway as the most important in the transmission of this infection. Molecular genotyping methods are essential for epidemiological studies on this parasite.
 
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Publishing Date
2007-09-17
 
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