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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.5.2017.tde-05012017-150738
Documento
Autor
Nome completo
Marcelo Pitelli Turco
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2016
Orientador
Banca examinadora
Gomes, Cristiano Mendes (Presidente)
Antunes, Alberto Azoubel
Fratini, Paula
Lucon, Marcos
Truzzi, Jose Carlos Cezar Ibanhez
Título em português
Terapia celular com células mononucleares derivadas de músculo estriado esquelético na deficiência esfincteriana em modelo animal de incontinência urinária
Palavras-chave em português
Células musculares
Células-tronco
Incontinência urinária
Regeneração
Terapia baseada em transplante de células e tecidos
Uretra
Resumo em português
INTRODUÇÃO: Este estudo teve por objetivo investigar o efeito da injeção periuretral de células mononucleares derivadas de músculo estriado esquelético (CMDME) e a incorporação dessas células no esfíncter urinário de ratas, em modelo animal de incontinência urinária. MÉTODOS: As CMDMEs, foram isoladas de músculos dos membros pélvicos de ratos endogâmicos Whistar-Kyoto (WKY), machos. Os músculos foram submetidos à dissociação enzimática, seguida de isolamento das células mononucleares, sem necessidade de cultura e/ou expansão. A deficiência esfincteriana foi criada por uretrolise cirúrgica em 20 ratos endogâmicos WKY, fêmeas. Uma semana após, foi realizada a injeção periuretral de 1 x 106 de células, em 10 ratas (grupo CMDME), e 10 ratas receberam injeção de SF a 0,9% (grupo SF). Dez animais foram submetidos à cirurgia Sham e serviram como controle (grupo SHAM). Quatro semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados, e as uretras, removidas. A incorporação das CMDMEs masculinas, na uretra feminina, foi confirmada pela detecção do cromossomo Y, através da hibridização in situ fluorescente. A porção média da uretra de cada animal foi processada para coloração pela hematoxilina-eosina e tricrômio de Masson e também imuno-histoquímica para actina e miosina. Usando software digital (Image Pro Plus 6.0), calcularam-se a proporção músculo/tecido conectivo e a proporção de actina e miosina em cada amostra de uretra, sendo as proporções comparadas entre os grupos. As mudanças morfométricas da uretra de cada animal, de cada grupo, foram avaliadas medindo-se o maior e o menor diâmetro da uretra e a espessura média da parede, utilizando software digital (Image J); áreas fracionais da luz, mucosa e camada muscular da uretra foram estimadas usando o método de contagem de pontos. RESULTADOS: No grupo CMDME, houve espessamento das camadas da musculatura lisa e estriada, e menor depósito de tecido conectivo, em relação aos animais do grupo SF. Uma diminuição da proporção músculo/tecido conectivo foi observada no grupo SF, em comparação ao grupo CMDME, e também em relação ao grupo SHAM (0,51 ± 0,28; 1,62 ± 0,53 e 2,27 ± 1,15, respectivamente, p < 0.001). A proporção de actina estava diminuída no grupo SF, em comparação com o grupo CMDME, e com o grupo SHAM (0,18 ± 0,04; 0,27 ± 0,02 e 0,27 ± 0,03, respectivamente, p < 0,001) sendo também observada esta diminuição na proporção de miosina (0,07 ± 0,01; 14 ± 0,02 e 0,15± 0,03, respectivamente, p < 0,001). Não houve diferença entre os grupos SF, CMDME e SHAM em relação ao diâmetro da uretra, espessura da parede uretral e áreas fracionais da luz, mucosa e parede muscular uretral. CONCLUSÕES: As CMDMEs foram incorporadas na uretra do grupo CMDME. Nestes animais, houve diminuição de tecido conectivo e aumento da quantidade de músculo liso e esquelético. As CMDMEs foram facilmente obtidas, sem necessidade de expansão celular, com pequeno tempo de preparo
Título em inglês
Cell therapy with skeletal muscle-derived mononuclear cell in the sphincter deficiency in an animal model of urinary incontinence
Palavras-chave em inglês
Cell and tissue-based therapy
Muscle cells
Stem cells
Urethra, Regeneration
Urinary incontinence
Resumo em inglês
INTRODUCTION: This study investigated the effect of periurethral injection of skeletal muscle-derived mononuclear cells (SMDMCs) into the urethral sphincter in an animal model of stress urinary incontinence (SUI). METHODS: SMDMCs were isolated from the hind limb muscles of male Wistar-Kyoto (WKY) isogenic inbred rats. The muscles were enzymatically dissociated, and SMDMCs were directly isolated without the need for culture or expansion. Urinary sphincter deficiency was created by surgical urethrolysis in 20 female WKY rats. One week later, 10 rats received an injection of 1 x 106 cells (SMDMC group) and 10 rats received saline injections (Saline group). In addition, 10 rats were subjected to sham surgery (Sham group). Four weeks later, the rats were euthanized and their urethras harvested. The incorporation of male SMDMC in the female urethras was confirmed by the detection of Ychromosomes by fluorescence in situ hybridization (FISH). In addition, hematoxylin and eosin (H&E) and Masson's trichrome staining, as well as immunohistochemistry analyses to actin and myosin were performed. Using digital software (Image Pro Plus 6.0), the muscle to connective tissue, actin and myosin ratios were calculated. A urethral morphological evaluation was conduced by measuring the diameters and mean wall thickness, using Image J software. Fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer were estimated using the point counting method. RESULTS: The SMDMCs were successfully incorporated into the urethra. Less collagen was observed among the muscle fibers and less atrophy was found in the smooth and skeletal muscle layers of the SMDMC group. A significant decrease in the muscle to connective tissue ratio was observed in the Saline group, compared with the SMDMC and Sham groups (0,51 ± 0,28 vs 1,62 ± 0,53 vs 2,27 ± 1,15, respectively; p < 0.001). The proportion of the actin was decreased in the Saline group, in comparison with the SMDMC and Sham groups (0,18 ± 0,04 vs 0,27 ± 0,02 vs 0,27 ± 0,03, respectively; p < 0,001); a decrease was also observed in the proportion of myosin (0,07 ± 0,01 vs 0,14 ± 0,02 vs 0,15± 0,03, respectively; p < 0,001). No significant differences were observed among the groups Sham, Saline and SMDMC in terms of urethral diameter, urethral wall thickness and fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer. CONCLUSIONS: The SMDMCs that were incorporated into the injured urethral sphincter resulted in decreased connective tissue and increased muscle content in the SMDMC group. SMDMCs were easily obtained, without need for cell expansion, and they only required a brief preparation time
 
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Data de Publicação
2017-01-09
 
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