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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2019.tde-06122019-113038
Documento
Autor
Nome completo
Amanda Duran
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Brentani, Maria Mitzi (Presidente)
Nagai, Maria Aparecida
Rangel, Maria Cristina Rodrigues
Santos, Tiago Góss dos
Título em português
Determinação de microRNAs circulantes em plasma de pacientes jovens e de meia idade com câncer de mama
Palavras-chave em português
Comunicação celular
Epigenômica
Expressão gênica
MicroRNAs
Neoplasias da mama
Resumo em português
INTRODUÇÃO: Câncer de mama em pacientes jovens é uma condição rara (4% dos casos) e parece apresentar um pior prognóstico para essas pacientes quando comparado com as mais velhas. Um estudo anterior do grupo, comparou a expressão de microRNAs (miRs) entre tumores de pacientes jovens (<=35 anos) e de meia-idade (50-69 anos) e foram encontradas diferenças em 8 miRs (miR-9, miR-106a, miR-106b, miR-18b, miR-210, miR-33b, miR-518a-3p and miR-372). Nosso objetivo principal foi verificar se a diferença de expressão encontrada no tumor está refletida também no plasma, comparando a expressão desses 8 miRs circulantes entre dois grupos de idade com câncer de mama ductal invasivo, luminal e baixo risco de mutação em BRCA1/2. MÉTODOS: Foram realizadas consultas a prontuários das pacientes admitidas no Serviço de Mastologia do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP) (Abril/2016 até Abril/2018) e selecionadas amostras de plasma de pacientes jovens (GJ com <=35 anos) e de pacientes de meia-idade (GMI com 50-69 anos). No GJ também foram incluídas pacientes do Hospital do Câncer de Barretos com o mesmo diagnóstico. Essas pacientes possuíam diagnóstico confirmado de carcinoma mamário ductal invasivo, luminal (A, B ou luminal HER-2+), sem histórico familiar de câncer de mama com amostras coletadas antes de qualquer tipo de tratamento. Foi realizada extração de RNA total dessas amostras de plasma e feita a determinação de expressão dos 8 miRs por meio de real-time PCR (qPCR) e comparada entre os grupos de idade. Para determinar se esses miRs eram encontrados também presentes dentro de vesículas extracelulares (VEs), estas foram isoladas por ultracentrifugação e quantificadas por Nanosight e o RNA contido nas VEs foi extraído e a expressão dos miRs foi determinada por qPCR. Os resultados foram analisados usando o teste de Mann-Whitney. RESULTADOS: Foram selecionadas amostras de plasma de 24 pacientes do GJ, (15 do ICESP e 9 do Hospital do Câncer de Barretos) e de 21 pacientes do GMI. Nessas amostras, dos 8 miRs avaliados, 6 foram encontrados circulantes e apenas dois (miR-372 e miR-518a-3p) não apresentaram expressão em nenhuma amostra. O cálculo da expressão relativa foi realizado com duas possibilidades de combinação de miRs como normalizadores (miR-18b e miR-21; miR-18b e miR-425), conforme resultado encontrado utilizando o programa Normfinder e por meio do cálculo de Delta Ct/Desvio Padrão, respectivamente. E, em ambas condições, o miR-9 foi detectado com maior nível de expressão nas pacientes do GJ quando comparado com a expressão das pacientes do GMI (p= 0,03 e p= 0,01). Na análise de genes-alvo desse miR, foi observado que as principais vias reguladas estão relacionadas principalmente com motilidade celular, regulando genes envolvidos em importantes vias como ILK e transição epitélio-mesênquima. Os demais miRs circulantes não apresentaram diferenças de expressão entre os grupos de idade. Também não houve diferença na quantidade de VEs encontradas no plasma (p= 1,0). A expressão dos 8 miRs também foi avaliada nas amostras de VEs isoladas e foi observado que o miR-106a, embora presente em todas as amostras de plasma como um miR circulante, não é transportado dentro das VEs, enquanto o miR-9, miR-106b e o miR-18b foram encontrados presentes em todas as amostras de VEs avaliadas. CONCLUSÕES: os tumores de pacientes jovens parecem apresentar determinadas características biológicas diferentes, como a expressão do miR-9, importante miR relacionado principalmente com invasão e associado com um pior prognóstico. Um maior acompanhamento dessas pacientes será importante para determinar a real influência desse miR na progressão tumoral e compreender as diferenças biológicas encontradas nos tumores de mama jovem
Título em inglês
Determination of circulating microRNAs in plasma of young and middle-age breast cancer patients
Palavras-chave em inglês
Breast neoplasms
Cell communication
Epigenomics
Gene expression
MicroRNAs
Resumo em inglês
INTRODUCTION: Breast cancer in young women is rare (4% of all breast cancer cases) and tends to have a poorer prognosis than older women. A previous study of our group compared microRNAs (miRs) expression profiles between breast tumors of young (<=35 years) and middle-age women (50-69 years) and showed difference in expression of 8 miRs (miR-9, miR-106a, miR-106b, miR-18b, miR-210, miR-33b, miR-518a-3p and miR-372). Our main objective was to verify if the difference in expression observed in tissue was reflected in plasma with circulating miRs in the comparison of these two age groups with invasive ductal breast cancer, luminal subtype with low BRCA1/2 mutation risk. EXPERIMENTAL DESIGN: Medical reports were consulted to search patients who started treatment at Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP) (April, 2016 - April, 2018) and to select young (<=35 years - GJ) and middle-age women (50-69 years - GMI) with confirmed diagnosis of invasive ductal breast cancer, luminal subtype (A, B ou luminal HER-2+), with no family history and samples were collected before any type of tratment. Patients samples from Hospital do Câncer de Barretos (HCB) were included in the study too. The total RNA was extracted by chromatography from the plasma samples and qPCR was performed to determine the expression of miRs. To verify if these miRs were inside EVs too, they were isolated using ultracentrifugation and quantified with Nanosight LIM-14. The results were analyzed using Mann-Whitney test. RESULTS: Samples of 24 patients from GJ (15 from ICESP and 9 from HCB) and 21 from GMI were selected. In these samples, 6 from 8 miRs were found circulating and only two of them (miR-372 and miR-518a-3p) had no detectable expression in any sample. Two combinations of miRs were used to normalize data (miR-18b e miR-21; miR-18b and miR-425), using Normfinder software and Delta Ct Calculation/Standard Deviation, respectively. Under both conditions, miR-9 was detected with a higher level of expression in GJ patients when compared to GMI patients (p= 0,03 and p= 0,01). In the analysis of target genes of this miR, it was observed that the main regulated pathways are mainly related to cellular motility, regulating genes involved in important pathways such as ILK and epithelial-mesenchymal transition. The other circulating miRs did not show differences of expression between the age groups. There was also no difference in the amount of EVs found in plasma (p= 1,0). The expression of the 8 miRs was also evaluated in the isolated EVs samples and it was observed that miR-106a, although present in all plasma samples as a circulating miR, is not transported within the EVs, whereas miR-9, miR- 106b and miR-18b were found present in all samples of EVs evaluated. CONCLUSIONS: Tumors of young patients appear to have certain different biological characteristics, such as miR-9 expression, important miR mainly related to invasion and associated with a worse prognosis. Further follow-up of these patients will be important to determine the real influence of this miR on tumor progression and to understand the biological differences found in young breast tumors
 
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Data de Publicação
2019-12-06
 
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