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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.5.2019.tde-03012019-084530
Document
Auteur
Nom complet
Daniela Aparecida de Brito Cervilha
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2018
Directeur
Jury
Lopes, Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos (Président)
Carvalho, Celso Ricardo Fernandes de
Fló, Claudia Marina
Righetti, Renato Fraga
Velosa, Ana Paula Pereira
Titre en portugais
Estudo da resposta imunológica em modelo experimental da DPOC por exposição à fumaça de cigarro e exacerbação por instilação de LPS
Mots-clés en portugais
Células T regulatórias
Cigarro
Doença pulmonar obstrutiva crônica
Exacerbação
Fumaça
Interleucina-10
Lipopolissacarídeo
Resposta Th17
Resumé en portugais
O tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A importância da imunidade adaptativa para este processo não está totalmente esclarecida, entretanto a inflamação persistente está associada à ocorrência de infecções e exacerbação da DPOC. O nosso objetivo foi desenvolver um modelo experimental de exacerbação da DPOC utilizando a exposição à fumaça de cigarro e instilação de lipopolissacarídeo (LPS), visando investigar os aspectos imunológicos. Camundongos machos (C57BL/6), foram divididos em 4 grupos. Grupo controle salina (CSAL) e grupo controle LPS (CLPS) que foram expostos ao ar filtrado durante 12 semanas e receberam duas instilações intratraqueais (50µl) de salina ou LPS (1mg/kg) com intervalo de 15 dias entre cada instilação e o grupo fumo salina (FSAL) e grupo fumo LPS (FLPS) que foram expostos à fumaça de cigarro e também receberam duas instilações intratraqueais de salina ou LPS com o mesmo intervalo de tempo entre as instilações e a mesma dosagem. Após 3 dias da última instilação os animais foram anestesiados, traqueostomizados e acoplados a um ventilador para pequenos animais para avaliação da mecânica respiratória. Em seguida, fizemos a coleta do lavado broncoalveolar (LBA) para avaliar o perfil inflamatório e posteriormente, os pulmões foram removidos e feitos cortes para análise do intercepto linear médio (Lm) subpleural e peribronquial, além da espessura epitelial. Também avaliamos a densidade de macrófagos, neutrófilos, células T CD4+, CD8+ e células T regulatória (Treg), células positivas para Stat3/5 e FosfoStat3/5 no parênquima pulmonar por imuno-histoquímica. Além disso, foram analisados por ELISA no homogenato pulmonar os fatores quimiotáticos (KC/CXCL1 e MIP-2/CXCL2) e interleucina (IL) (-17, -6, -10) e interferon gama (IFN-y). Observamos alteração da mecânica do sistema respiratório com aumento da resistência tecidual (Gtis) e elastância tecidual (Htis) nos animais expostos á fumaça de cigarro e desafiados com LPS. Nos grupos FSAL e FLPS observamos aumento de Lm (regiões subpleurais), e no grupo FLPS também observamos aumento de Lm nos espaços peribrônquicos e espessamento epitelial. A associação da fumaça de cigarro e o LPS, além de ter causado dano ao parênquima pulmonar mais difuso tanto em regiões subpleurais quanto em espaços peribrônquicos intensificou a resposta inflamatória com aumento de neutrófilos, macrófagos, células T CD4+, células positivas para Stat3, FosfoStat5 e CXCL2. A densidade das células Treg, os níveis de IL-17 e IL-6 aumentaram em ambos os grupos LPS, enquanto o nível de IL-10 aumentou apenas no grupo CLPS. O aumento das células positivas para Stat3 -5, FosfoStat3 -5, corrobora com valores mais elevados para as células IL-17 e Treg. Assim, nosso estudo demonstrou que embora a associação da fumaça de cigarro e o LPS tenha induzido a diferenciação das células Th17 e Treg, não observamos aumento da expressão de IL-10 e sim da expressão de IL-17 sugerindo que uma falha na produção de IL-10 desempenha um papel fundamental na exacerbação do processo inflamatório
Titre en anglais
Study of the immune response in an experimental model of COPD by exposure to cigarette smoke and exacerbation by LPS instillation
Mots-clés en anglais
Chronic obstructive pulmonary disease
Cigarette
Exacerbation
Interleukin-10
Lipopolysaccharide
Regulatory t cells
Smoke
Th17 response
Resumé en anglais
The tobacco smoking is the main risk factor for the development of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). The importance of adaptive immunity for this process is not completely clear, however there are studies attesting the association of infection with COPD exacerbation. We propose an experimental model of COPD exacerbation using a traditional method of cigarette smoke (CS) combining with lipopolysaccharide (LPS) instillations, focusing on the adaptive immunity response. C57BL/6 male mice were exposed to room air or to CS and after 3 months, they received two instillations of saline or LPS (Control/SAL; Control/LPS; CS/SAL and CS/LPS groups). Animals were anesthetized to perform the respiratory mechanics and inflammatory profile in broncho alveolar lavage (BAL) and lungs were removed to evaluate the mean linear intercept (Lm), the density of macrophages, neutrophils, CD4+ and CD8+ cells, regulatory T cells (Treg), signal transducer and activator of transcription (Stat) 3, 5 and phosphoStat 3, 5. The chemotactic factors (CXCL1 and CXCL2); interleukins (IL): -17, -6, -10 and INF-y were measured in lung using Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). We observed a change in the mechanics of the respiratory system with increased tissue resistance (Gtis) and tissue elastance (Htis) in CS/LPS group. In addition, in CS/Sal and CS/LPS groups we observed increase of Lm (subpleural), and in CS/LPS group we observed the increase in Lm in peribronchial spaces. CS exposure and LPS challenge induced an increase in neutrophils, macrophages, CD4+ and CD8+ T cells. CS/LPS challenge association intensified this response and lung parenchyma damage. Treg density cells, IL-17 and IL-6 levels was increased in both LPS groups, while IL-10 level was increased only in Control/LPS group. The increase of Stat3, -5, PhosphoStat3, -5 positive cells corroborates with higher values for IL-17 and Treg cells. Although the CS/LPS challenge association induced both Th17 and Treg cells differentiation, there is no increase for IL-10 expression, suggesting that a failure in IL-10 production play a pivotal role in the inflammatory process exacerbation
 
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Date de Publication
2019-01-04
 
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