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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.5.2005.tde-15022006-203659
Document
Author
Full name
Milena Garcia Abrão
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2005
Supervisor
Committee
Mendonca, Berenice Bilharinho de (President)
Abucham Filho, Júlio Zaki
Giacaglia, Luciano Ricardo
Rocha, Dalva Marreiro
Vieira, Teresa Cristina Alfinito
Title in Portuguese
"Análise do gene PROP1 em pacientes com hipopituitarismo: estudo em DNA de células de mucosa oral e sangue periférico extraído com NaCI"
Keywords in Portuguese
DELEGAÇÃO DE GENES
DNA
FATORES GENÉRICOS DE TRANSCRIÇÃO
HIPOPITUITARISMO
MUTAÇÃO
Abstract in Portuguese
As mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum da deficiência combinada de hormônios hipofisários. Até o momento, diversas mutações missense e pequenas deleções foram descritas sendo a mutação 301-302 delAG a mais freqüente. Nosso objetivo foi estudar as mutações em DNA de pacientes com hipopituitarismo e padronizar a extração de DNA de células de swab oral, usando um método com NaCl e comparar com um kit comercial (Purigene, Minneapolis, EUA). Amplificamos os 3 exons do gene PROP1 do DNA obtido de células orais e de sangue periférico. Identificamos a mutação 301-302delAG em 6 pacientes, 4 em homozigose (33%) e 2 em heterozigose (16%) e a mutação G51A em heterozigose em um único paciente. Em dois irmãos, filhos de pais consangüíneos, não foi possível amplificar os 3 exons do gene PROP1 enquanto que os os genes LHX3 e LHX4 foram amplificados com sucesso. Para confirmar a hipótese de deleção do PROP1, o Southern blotting foi realizado usando como sonda o produto de PCR do exon 2 do gene PROP1 e um fragmento do gene CYP21A2 como sonda controle. A banda referente ao CYP21A2 estava presente nos pacientes e nos controles enquanto a banda referente ao PROP1 estava ausente nos irmãos e presente na mãe e nos controles. Para definir a extensão da deleção usamos um mapa de STS próximos ao gene e o STS GDB:314805 localizado a 6,0 kb a montante do PROP1 não foi amplificado nos pacientes. Entretanto, o gene Q8N6H0 a 18 kb a juzante e o STS WI-16216 a 59 kb a montante do PROP1 foram amplificados com sucesso nos pacientes e controles indicando que a deleção está localizada dentro de 81 Kb. Para determinar os limites da deleção, várias reações de PCR foram realizadas com primers desenhados progressivamente distantes de gene PROP1, cobrindo toda a região. Isto nos permitiu determinar a região deletada de 9,6 kb a juzante e 11 kb a montante do gene PROP1, com o tamanho máximo deletado de 18,4 kb. Por ambos os métodos de extração obtivemos um DNA de boa qualidade, permitindo o amplificação dos 3 exons do gene PROP1. A extração com NaCl foi mais rápida e mais barata resultando em maior quantidade de DNA quando comparada com o kit comercial. Em conclusão, descrevemos a deleção completa do gene PROP1 em dois irmãos com o fenótipo clássico de hipopituitarismo associado à hipófise hipoplásica ou aumentada e padronizamos a extração de DNA de células de mucosa oral com NaCl, que apresentou custo mais baixo e resultado mais rápido quando comparado a extração por um kit comercial, indicando que o swab oral é uma fonte prática de obtenção de DNA para estudos genéticos.
Title in English
Analysis of PROP1 gene in patients with hypopituitarism: study in DNA from blood and oral cells extracted with NaCl.
Keywords in English
DNA
GENES DELETION
HYPOPITUITARISM
MUTATION
TRANSCRIPTION FACTOR
Abstract in English
PROP1 gene mutations are the most common cause of genetic combined pituitary hormone deficiency. To date, several missense mutations and small deletions have been described and the 301-302 del AG is the most frequent. Our objective was to study PROP1 mutations in patients with hypopituitarism and standardize DNA extraction from an oral swab, using the NaCl method, comparing it with a commercial kit (Purigene, Minneapolis, USA). We amplified the 3 exons of PROP1 gene in DNA obtained from oral cells and peripheral blood cells. We identified the delAG301-302 mutation in 6 patients, 4 in homozygous (33%) and 2 in heterozygous (16%) state and G51A mutation in heterozygous state in a single patient. In two siblings, a boy and a girl, born to consanguineous parents we failed to amplify PROP1 gene by PCR whereas LHX3 and LHX4 genes were successfully amplified. To confirm the hypothesis of PROP1 gene deletion, Southern blotting was performed using PROP1 exon 2 gene PCR product as a probe and a fragment of CYP21A2 gene as a control probe. The CYP21A2 band was present in patients and controls whereas PROP1 band was absent in both siblings and present in their mother and in controls. To define the extension of this deletion we used STS mapping approach and no amplification for a STS GDB:314805 6.0 kb downstream of PROP1 was found. However, Q8N6H0 gene located 18 kb upstream and the STS WI-16216 located 59 kb downstream of PROP1 were successfully amplified indicating that the deletion is placed within 81 Kb. To determine the limits of the deletion a number of PCR covering this region were then carried out with primers located progressively distant from PROP1. This allowed us determine the deleted region from 9.6 kb upstream to 11 kb downstream of PROP with a maximum deletion size of 18.4 kb. Both methods yielded good quality DNA, allowing the amplification of 3 exons of PROP1 gene. The NaCl method showed to be faster and less expensive, resulting in a larger amount of DNA when compared with the commercial kit. In conclusion, we describe a complete deletion of PROP1 gene in two siblings with classical hypopituitarism phenotype associated with hypoplastic or enlarged pituitary gland and standardized the DNA extraction of oral cells with NaCl, which presented lower costs and faster results, when compared with the extraction by a commercial kit indicating that oral swabs are a reliable DNA source for genetic studies.
 
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milena.pdf (499.13 Kbytes)
Publishing Date
2006-02-24
 
WARNING: The material described below relates to works resulting from this thesis or dissertation. The contents of these works are the author's responsibility.
  • ABRÃO, M. G., et al. Combined pituitary hormone deficiency (CPHD) due to a complete PROP1 deletion [doi:10.1111/j.1365-2265.2006.02592.x]. Clinical Endocrinology (Oxford) [online], 2006, vol. 65, p. 294-300.
  • ABRÃO, M. G., et al. Padronização da técnica de extração de dna de células de mucosa oral com nacl: aplicação no estudo do gene PROP1 [doi:10.1590/S0004-27302005000600019]. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia [online], 2005, vol. 49, p. 978-982.
  • CARVALHO, L. R. S., et al. Factores de transcriptión que actúan en la formación de la hipófisis. Revista Argentina de Endocrinologia y Metabolismo, 2003, vol. 40, p. 191-200.
  • ABRÃO, M. G., et al. Alta frequência de mutações no gene PROP1 em pacientes com hipopituitarismo. In V COPEM CONGRESSO PAULISTA DE ENDOCRINOLOGIA E METABOLOGIA, São Paulo, 2003. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia.São Paulo, 2003. Resumo.
  • ABRÃO, M. G., et al. Comparação entre as extrações de DNA de células de mucosa oral por cloreto de sódio e kit comercial. In 38 Congresso Brasileiro de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial, Florianópolis/SC, 2004. Resumo.
  • ABRÃO, M. G., et al. Complete deletion of the PROP1 gene in two sibling with combined pituitary hormone deficiency (CPHD. In XVII Annual Meeting of the Sociedad Latinoamericana de Endocrinologia Pediatrica (SLEP), Lisboa, 2004. Journal of Pediatric Endocrinology & Metabolism., 2004. Abstract.
  • ABRÃO, M. G., et al. Deleção completa do gene PROP1 em dois irmãos com deficiência hihofisária hormonal múltipla. In 26o Congresso Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia, Florianópolis, 2004. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia., 2004. Resumo.
  • ABRÃO, M. G., et al. Deleção completa do gene PROP1 em dois irmãos com deficiência hipofisária hormonal múltipla. In 26o Congresso Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia, Florianópolis/SC, 2004. Resumo.
  • ABRÃO, M. G., et al. Higth frequency of mutations in PROP1 gene in patients with hypopituitarism. In 1 Simpósio Avanços em Pesquisas Médicas dos Laboratórios de Invest. Médica - HCFMUSP, São Paulo, 2003. Simpósio Avanços em Pesq. Médicas dos Lab. de Invest. Médica - HCFMUSP., 2003. Abstract.
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