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Doctoral Thesis
DOI
Document
Author
Full name
Daniela Kajihara
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Laurindo, Francisco Rafael Martins (President)
Bonatto, Diego
Marie, Suely Kazue Nagahashi
Yamaguchi, Ayumi Aurea Miyakawa
Title in Portuguese
Caracterização e investigação funcional de splicings alternativos do gene P4HB da dissulfeto isomerase proteica (PDI)
Keywords in Portuguese
Células de músculo liso
Isoformas de RNA
Isomerases de dissulfetos de proteínas
Músculo liso vascular
Processamento alternativo
Processamento de RNA
Retículo endoplasmático
Abstract in Portuguese
O splicing alternativo (AS) é um processo que produz diferentes mRNAs de um transcrito primário, resultando na produção de isoformas de proteínas que podem exibir propriedades funcionais distintas e localização subcelular. Mais de 90% dos genes humanos sofrem AS. O gene P4HB codifica a proteína PDIA1 (proteína dissulfeto isomerase-A1), uma chaperona redox composta basicamente por quatro domínios tiorredoxina. A PDIA1 exerce função esssencial na proteostase mediante funções como chaperona e isomerase ou oxido-redutase de grupos tiol em cisteínas, catalisando a inserção adequada de pontes dissulfeto em proteínas nascentes no retículo endoplasmático. A atividade de isomerase de PDI requer a presença de todos os seus domínios redox catalíticos (a e a') e os domínios não redox (b e b'), enquanto as isoformas poderiam possuir estruturas distintas e atuaream como oxidoredutases, ou apenas chaperonas. Ainda, a PDIA1, amplamente expressa, pode ter efeitos adicionais na homeostase celular. Nosso grupo tem caracterizado uma série de funções da PDIA1 na sinalização redox, homeostase e respostas biomecânicas, em alguns casos envolvendo locais de proteína subcelular adicionais, como na superfície celular ou no meio extracelular. No entanto, há muito pouca informação sobre a regulação, expressão e localização de transcritos derivados de processamento alternativo da PDI e a localização de diferentes produtos protéicos. Avanços recentes nos dados de NGS (Next Generation Sequencing) e proteômicos forneceram informações mais acuradas de variantes alternativamente processadas. A disponibilidade de dados de RNA-seq de diferentes fontes tornou possível a investigação de variantes de splicing usando uma quantidade razoável de dados, contemplando diferentes tipos e tecidos celulares. Usando três diferentes bases de dados RNA-seq, investigamos o perfil de isoformas alternativamente processadas da PDIA1. A análise das bases FANTOM5 (Anotação Funcional de Genoma de Mamíferos, que reuniu informações biológicas de 70 amostras de RNA-seq), Projeto ENCODE/Caltech e CSHL RNA-seq e Projeto GTEx (Genotype-Tissue Expression, um enorme banco de dados com mais de 10.000 amostras), identificamos a expressão das variantes de splicing do gene P4HB em diferentes tipos de células e linhagens celulares cancerígenas. A expressão das variantes de splicing do gene P4HB compreende 10 variantes que possuem a sequência de codificação de proteína. Desenvolvemos abordagens específicas para quantificar as variantes desse gene. Para validar a junção específica para cada variante de splicing, nós desenhamos oligonucleotídeos para amplificar a junção, clonamos e sequenciamos a região específica de cada uma das três variantes. Os dados indicam que a expressão das isoformas do gene P4HB é altamente variável entre os diferentes tecidos e células e mesmo entre diferentes tipos da mesma célula, por exemplo, células musculares lisas de aorta vs. coronária. A análise da sequência das isoformas mostra que apenas uma, a P4HB-021, tem os quatro domínios tiorredoxina, apenas duas conservam a sequência de retenção no retículo endoplasmático e várias tem truncamentos dos distintos domínios, sugerindo que os produtos proteicos derivados não devam apresentar atividadade isomerase canônica. Analisamos a expressão gênica de três variantes de splicing em células HEK293 e células musculares lisas primárias submetidas à carenciamento de soro, tratamento com tunicamicina e cloreto de cobalto para mimetizar a hipóxia. O gene da P4HB e da isoforma P4HB-021 foram responsivos ao carenciamento de soro em células musculares lisas humanas. A importância da isoforma P4HB-021 neste tipo celular foi também confirmada por análise de outros bancos de dados e experimentos da literatura. Interessante, a estrutura prevista para P4HB-021 indica uma proteína com maior mobilidade que a proteína canônica. Estes dados indicam uma base para o entendimento da regulação gênica do gene da PDIA1 e podem contribuir para o entendimento das diversas funções previamente descritas por nosso grupo para a PDIA1 neste tipo celular
Title in English
Characterization and functional investigation of P4HB splicing variants
Keywords in English
Alternative splicing
Endoplasmic Reticulum
Myocytes smooth muscle
Protein disulfide-isomerases
RNA isoforms
RNA splicing
Vascular smooth muscle
Abstract in English
More than 90% of human genes undergo AS. The P4HB gene encodes the PDIA1 protein (disulfide protein isomerase-A1), a redox chaperone composed primarily of four domains of thioredoxin. PDIA1 exerts essential function in proteostasis through functions such as chaperone and isomerase or oxido-reductase of thiol groups in cysteines, catalyzing the proper insertion of disulfide bridges into nascent proteins in the endoplasmic reticulum. The isomerase activity of PDI requires the presence of all its catalytic redox domains (a and a') and the non-redox domains (b and b'), while distinctly structured isoforms could act as oxidoreductases or just as chaperones. Furthermore, PDIA1, widely expressed, may have additional effects on cellular homeostasis. Our group has characterized a number of PDIA1 functions in redox signaling, homeostasis and biomechanical responses, in some cases involving additional subcellular localization, such as on the cell surface or in the extracellular environment. However, there is very little information on the regulation, expression and localization of transcripts derived from alternative PDI processing and the location of different protein products. Recent advances in NGS (Next Generation Sequencing) and proteomics data provided more accurately information from alternative splicing variants. The availability of RNA-seq data from different sources empowers the investigation of splice variants using a reasonable amount of data from cell types and tissues. Using three different RNA-seq databases, we investigated the alternatively processed isoform profile of PDIA1. The analysis of the FANTOM5 bases (Functional Annotation of Mammalian Genome, which collected biological information from 70 RNA-seq samples), ENCODE/Caltech Project and CSHL RNA-seq and GTEx Project (Genotype-Tissue Expression, a huge database with more than 10,000 samples), we identified the expression of P4HB splicing variants in different cell types and cancer cell lines. The expression of P4HB splicing variants comprises 10 variants with protein coding sequence. We developed specific approaches to quantify variants of this gene. To validate the specific junction for each splicing variant, we designed primers to amplify the splice junction, cloned and sequenced the specific region of each of the three variants. The data indicate that the expression of the isoforms of P4HB gene is highly variable between different tissues and cells and even between different types of the same cells, e.g. smooth muscle cells from coronary artery vs aorta. The analysis of isoforms sequence shows that only one, P4HB-021, has the 4 domains of thioredoxin, only two retain the retention sequence to endoplasmic reticulum and several truncations of the different domains, suggesting that the derived protein products should not present isomerase activity. We analyzed the gene expression of three splicing variants in HEK293 cells and primary smooth muscle cells submitted to serum starvation, treatment with tunicamycin and cobalt chloride to mimic hypoxia. The P4HB gene and the P4HB-021 isoform were responsive to serum starvation in human smooth muscle cells. The importance of the P4HB-021 isoform in this cell type was also confirmed by analysis of other databases and literature experiments. Interestingly, the predicted structure for P4HB-021 indicates a protein with greater mobility than the canonical protein. These data indicate a basis for understanding the gene regulation of the PDIA1 gene and may contribute to the understanding of the various functions previously described by our group for PDIA1 in this cell type
 
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Publishing Date
2019-11-11
 
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