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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.59.2016.tde-04052016-114918
Documento
Autor
Nome completo
Eduardo Geraldo de Campos
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2016
Orientador
Banca examinadora
Martinis, Bruno Spinosa de (Presidente)
Dorta, Daniel Junqueira
Malfará, Wilson Roberto
Título em português
Zebrafish como organismo-modelo para análises de efeitos comportamentais e toxicológicas da cetamina empregando cromatografia em fase gasosa e estatística multivariada
Palavras-chave em português
Cetamina
Cromatografia em Fase Gasosa acoplada ao Detector de Nitrogênio-Fósforo
Estatística Multivariada.
Zebrafish
Resumo em português
A cetamina é uma droga amplamente utilizada e o seu uso inadequado tem sido associado à graves consequências para a saúde humana. Embora as propriedades farmacológicas deste agente em doses terapêuticas sejam bem conhecidas, existem poucos estudos sobre os efeitos secundários induzidos por doses não-terapêuticas, incluindo os efeitos nos estados de ansiedade e agressividade. Neste contexto, os modelos animais são uma etapa importante na investigação e elucidação do mecanismo de ação a nível comportamental. O zebrafish (Danio rerio) é um novo organismo-modelo, interessante e promissor, uma vez que apresenta alta similaridade fisiológica, genética e neuroquímica com seres humanos, respostas comportamentais bem definidas e rápida absorção de compostos de interesse em meio aquoso além de apresentar uma série de vantagens em relação aos modelos mamíferos tais como manutenção de baixo custo, prática e executável em espaços reduzidos. Nesse sentido, faz-se necessário a execução de ensaios comportamentais em conjunto com análises estatísticas robustas e rápidas tais como ANOVA e Métodos Multivariados; e também o desenvolvimento de métodos analíticos sensíveis, precisos e rápidos para determinação de compostos de interesse em matrizes biológicas provenientes do animal. Os objetivos do presente trabalho foram a investigação dos efeitos da cetamina sobre a ansiedade e a agressividade em zebrafish adulto empregando Testes de Claro-Escuro e Testes do Espelho e métodos estatísticos univariados (ANOVA) e multivariados (PCA, HCA e SIMCA) assim como o desenvolvimento de método analítico para determinação da cetamina em matriz biológica proveniente do animal, empregando Extração Líquido-Líquido e Cromatografia em Fase Gasosa acoplada ao Detector de Nitrogênio-Fósforo (GC-NPD). Os resultados comportamentais indicaram que a cetamina produziu um efeito significativo dose-dependente em zebrafish adulto na latência à área clara, no número de cruzamentos entre as áreas e no tempo de exploração da área clara. Os resultados das análises SIMCA e PCA mostraram uma maior similaridade entre o grupo controle e os grupos de tratamento expostos às doses mais baixas (5 e 20 mg L-1) e entre os grupos expostos às doses de 40 e 60 mg L-1. Na análise por PCA, dois componentes principais responderam por 88,74% de toda a informação do sistema, sendo que 62,59% da informação cumulativa do sistema foi descrito pela primeira componente principal. As classificações HCA e SIMCA seguiram uma evolução lógica na distribuição das amostras por classes. As doses mais altas de cetamina induziram uma distribuição mais homogênea das amostras enquanto as doses mais baixas e o controle resultaram em distribuições mais dispersas. No Teste do Espelho, a cetamina não induziu efeitos significativos no comportamento dos animais. Estes resultados sugerem que a cetamina é modulador de comportamentos ansiosos, sem efeitos indutores de agressividade. Os resultados da validação do método cromatográfico indicaram uma extração com valores de recuperação entre 33,65% e 70,89%. A curva de calibração foi linear com valor de R2 superior a 0,99. O limite de detecção (LOD) foi de 1 ng e o limite de quantificação (LOQ) foi de 5 ng. A exatidão do método cromatográfico manteve-se entre - 24,83% e - 1,258%, a precisão intra-ensaio entre 2,67 e 14,5% e a precisão inter-ensaio entre 1,93 e 13,9%.
Título em inglês
Zebrafish as an organism-model for analysis of behavioral effects and toxicological analysis of ketamine employing gas chromatography and multivariate statistics
Palavras-chave em inglês
Gas Chromatography coupled with Nitrogen-Phosphorus Detector
ketamine
Multivariate Statistics
zebrafish
Resumo em inglês
Ketamine is a widely used drug and its inappropriate use has been associated with serious consequences for human health. Although the pharmacological properties of this agent in therapeutic doses are well known, there are few studies about the side effects induced at non-therapeutic doses, including the effects on states of anxiety and aggression. In this context, animal models are an important step in the investigation and elucidation of the mechanism of action at the behavioral level. The zebrafish (Danio rerio) is a new organism model, interesting and promising, since it presents high physiological, genetics and neurochemistry similarity in relation to humans, well-defined behavioral responses and rapid absorption of interesting compounds in an aqueous medium, apart from presents several advantages over mammalian models such as practical, low cost maintenance and executable in reduced spaces. In this sense, it is necessary to perform behavioral tests in conjunction with robust and rapid statistical analysis such as ANOVA and multivariate methods; and also the development of sensitive, accurate and rapid analytical methods to determination of compounds of interest in biological matrices from the animal. The objectives of this study were to investigate the effects of ketamine on anxiety and aggression in adult zebrafish using Light-Dark and Mirror Biting tests and univariate (ANOVA) and multivariate (PCA, HCA and SIMCA) statistical methods and to develop an analytical method for determination of ketamine in biological animal matrices using Liquid-Liquid Extraction and Gas Chromatography coupled with Nitrogen-Phosphorus Detector (GC-NPD). The behavioral results of Light-Dark Test indicated that ketamine produced a significant dose-dependent response in the latency to light area, in the number of midline crossings and in the time spent in light area. Results of SIMCA and PCA analysis showed a greater similarity between the control group and treatment groups exposed to lower doses (5 and 20 mg L-1) and between the treatment groups at doses of 40 and 60 mg L-1. In the analysis PCA, two principal components accounted for 88,74% of all the system information and 62,59% of the cumulative information of the system were described for the first principal component. The HCA and SIMCA results showed a logical evolution in the distribution of samples per class. The higher dose of ketamine induced a more homogeneous distribution of the samples while the lower doses and control resulted in more dispersed distribution. In the Mirror Test, ketamine induced no significant effect on the behavior of animals. These results suggest that ketamine is a modulator of anxious behavior without inducing aggressive effects. The results of the validation of chromatographic method indicated an extraction with recovery ranged between 33,65% to 70,89%. Calibration curve was linear with R2 value higher than 0,99. The limit of detection (LOD) was 1 ng and the limit of quantification (LOQ) was 5 ng. The accuracy of gas chromatographic method ranged between - 24,83% and - 1,258%, intra-assay precision between 2,67 and 14,5% and inter-assay precision between 1,93 and 13,9%.
 
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Data de Publicação
2016-06-22
 
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