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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.59.2018.tde-06072018-110632
Document
Author
Full name
Adriana Ferreira Lopes Vilela
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2018
Supervisor
Committee
Cardoso, Carmen Lúcia (President)
Carvalho, Ivone
Bolzani, Vanderlan da Silva
Cass, Quezia Bezerra
Moraes, Marcela Cristina de
Title in Portuguese
Co-imobilização das enzimas acetilcolinesterase e B-secretase1: estudo de condições para triagem de ligantes
Keywords in Portuguese
Acetilcolinesterase
B-secretase
Co-imobilização de enzimas
Doença de Alzheimer
Triagem de ligantes
Abstract in Portuguese
As enzimas, acetilcolinesterase (AChE) e ?-secretase1 (BACE1), são alvos validados para o tratamento da Doença de Alzheimer (DA) uma vez que atuam no sistema nervoso central contribuindo para o avanço da doença. Neste contexto, o interesse por inibidores destas enzimas e a busca por ensaios enzimáticos seletivos e eficazes tem importância crucial. Neste trabalho é descrito o desenvolvimento de metodologias on-line, em capilares de sílica fundida, e off-line, em esferas de agarose para triagem de ligantes envolvendo as enzimas AChE e BACE1 via imobilização e co-imobilização por ligação covalente. Nos métodos on-line, a imobilização da BACE1 e a co-imobilização das enzimas AChE e BACE1 em capilares de sílica fundida foram realizadas via ligação amino-glutaraldeído e as atividades das enzimas foram monitoradas on-line por cromatografia líquida de alta de eficiência e espectrometria de massa (CLAE-EM) através da medida das massas correspondentes aos produtos das clivagens enzimáticas. Nestes, foram possíveis se determinar os parâmetros cinéticos para as enzimas imobilizadas como; variações de pH e temperatura, as constantes cinéticas (KMap) e validação com inibidores padrão. Ressaltando também a aplicação na triagem de uma coleção de oito compostos sintéticos com identificação de dois compostos e a caracterização dos mesmos. Nos métodos off-line, a imobilização da AChE e da BACE1 em suportes de agarose foram realizadas partindo de diferentes tipos de ligação com grupos nucleófilos previamente ligados ao suporte. Os diferentes suportes de agarose com a AChE imobilizada foram estudados usando o propionato de p-nitrofenil como substrato por meio da medida da absorbância do produto formado p-nitrofenol a 348 nm. O sistema com a enzima imobilizada agarose-trietilamina-AChE (agarose-TEA-AChE) ótimo foi utilizado para validação do método para triagem de ligantes com o inibidor padrão sendo determinado os parâmetros cinéticos e termodinâmicos de inibição, tais como; potência inibitória (IC50), constante de inibição (Ki) e constante de dissociação (KD). Já para a enzima BACE1, a atividade enzimática foi monitorada por fluorescência a ?em= 495 nm (?ex= 395 nm) utilizando o substrato IV, sendo possível a seleção do melhor método para imobilização da BACE1. Em ambos os métodos, on-line e off-line, a imobilização foi eficiente refletindo na atividade de cada enzima após o processo. Os métodos para triagem desenvolvidos neste trabalho são inéditos para ambas as enzimas e reportam grandes avanços comparados aos ensaios já consolidados, uma vez que a co-imobilização contribuiu para a construção de um modelo de triagem inovador, sendo possível a avaliação das interações específicas de um ligante contra dois alvos biológicos em um mesmo sistema (CLAE-EM) automatizado. Ressaltando também que os métodos com a AChE e BACE1 em duas matrizes distintas forneceram modelos de ensaios com formatos diferentes que podem ser aplicados de acordo com as ferramentas analíticas disponíveis, desde as mais simples como espectrofotometria no UV-Vis, fluorescência, aos mais sofisticados e automatizados como CLAE-EM.
Title in English
Co-immobilisation of enzymes acetylcholinesterase and ?-secretase1: study of conditions for screening ligands.
Keywords in English
Acetylcholinesterase
Alzheimer's disease
B-secretase1
Co-immobilization of enzyme
Screening inhibitors
Abstract in English
The enzymes, acetylcholinesterase (AChE) and ?-secretase1 (BACE1), are targets validated for the treatment of Alzheimer's Disease (AD) because they act in the central nervous system contributing to the disease advance. In this context, the interest in inhibitors of these enzymes and the search for selective and effective enzymatic assays is of crucial importance. This work describes the development of on-line methodologies, in fused silica capillaries, and off-line in agarose beads for screening ligands involving the AChE and BACE1 enzymes via immobilization and co-immobilization by covalent attachment. In the on-line methods the immobilization of BACE1 and co-immobilization of AChE and BACE1 enzymes in fused silica capillaries were performed via amino-glutaraldehyde bonding and the enzyme activities were monitored on-line employing high performance liquid chromatography and mass spectrometry (HPLC-MS) by measuring the masses corresponding to the products of the enzymatic cleavages. In these enabled the determination of kinetic parameters for immobilized enzymes such as; pH and temperature variations, kinetic constants (KMap) and validation with standard inhibitors. Also, the application in the screening of a collection of eight synthetic compounds with identification and characterizations of two compounds was carried out. In the off-line methods, the immobilizations of AChE and BACE1 on agarose supports were performed through different types of binding with nucleophilic groups previously attached to the support. The different active-agarose supports with immobilized AChE were studied using p-nitrophenyl propionate as substrate by measuring the absorbance of the product formed p-nitrophenol at 348 nm. The system with the immobilized enzyme optimal agarose-triethylamine-AChE (agarose-TEA-AChE) was used for validation of the method for screening ligands with the standard inhibitor being determined the kinetic and thermodynamic parameters of inhibition, such as; inhibitory power (IC50), inhibition constant (Ki) and dissociation constant (KD). For BACE1 enzyme, the enzymatic activity was monitored by fluorescence at ?em = 495 nm (?ex = 395 nm) using the substrate IV, and it was possible to select the best method for immobilization of BACE1. In both methods, both on-line and off-line, the immobilizations procedures were efficient reflecting on the activity of each enzyme after the process. The screening methods developed in this work are unprecedented for both enzymes and represent an improvement to the already consolidated screenings assays, because the co-immobilization contributed to the construction of an innovative screening model, being possible the evaluation of the specific interactions of a ligand against two biological targets in the same automated system. It is worth emphasizing that the AChE and BACE1 methods in two different matrices have provided models of assays in different format that can be applied according to the available analytical tools, from the simplest ones such as UV-Vis spectrophotometry, fluorescence, to the automated systems such as HPLC-MS.
 
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Release Date
2022-03-23
Publishing Date
2018-07-30
 
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