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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.59.2016.tde-20042016-065052
Documento
Autor
Nome completo
Fernando Cruvinel Damasceno
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2015
Orientador
Banca examinadora
Toledo Junior, José Carlos (Presidente)
Dorta, Daniel Junqueira
Meotti, Flavia Carla
Monteiro, Hugo Pequeno
Silva, Roberto Santana da
Título em português
Mecanismos e a influência de ferro lábil em processos nitrosativos intracelulares utilizando o indicador fluorescente 4,5 diamino fluoresceína
Palavras-chave em português
diaminofluoresceína
ferrol lábil
LIP
macrófagos
nitrosação
óxido nítrico
radicais livres
Resumo em português
Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos.
Título em inglês
Mechanisms and the role of labile iron pool in intracelular nitrosative processes using 4,5 diaminofluorescein as a probe
Palavras-chave em inglês
Labile iron pool
Nitric Oxide
nitrosation
oxidative nitrosylation
peroxynitrite
RAW 264.7 cells
superoxide
Resumo em inglês
In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.
 
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TeseCorrigida.pdf (1.73 Mbytes)
Data de Publicação
2016-05-12
 
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