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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.59.2013.tde-26112013-203126
Document
Auteur
Nom complet
Lídia Renata Zanão
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2013
Directeur
Jury
Oliveira, Anderson Rodrigo Moraes de (Président)
Assis, Marilda das Dores de
Gaitani, Cristiane Masetto de
Titre en portugais
Avaliação de fungos e complexos de salen na obtenção do metabólito quiral e ativo terbutalina
Mots-clés en portugais
Análise enantiosseletiva
Bambuterol
Biotransformação
DLLME.
Terbutalina
Resumé en portugais
Enantiômeros podem interagir de maneira diferenciada no organismo, ocasionando efeitos farmacológicos variados. Dessa forma, metodologias para a obtenção de fármacos enantiomericamente puros são importantes para a indústria farmacêutica. Modelos sintéticos empregando reagentes quirais, como complexos de salen e modelos biológicos utilizando fungos estão sendo muito estudados neste contexto. O uso de fungos apresenta como principais vantagens o crescimento rápido, baixo custo e fácil operação, além da produção de metabólitos em grande quantidade. Complexos de salen são eficientes e estáveis, possuindo ampla aplicabilidade e possibilidade de produzir reações enantiosseletivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar fungos e complexo de salen como alternativas na produção enantiosseletiva de terbutalina, o metabólito quiral e ativo de seu pró-fármaco, o bmbuterol. A separação enantiosseletiva dos analitos foi realizada empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV-Vis (LC/UV). A validação da metodologia analítica e os estudos de biotransformação foram executados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A resolução do bambuterol e da terbutalina por LC/UV foi realizada utilizando como fase estacionária a coluna Chirobiotic T e como fase móvel acetonitrila:metanol (80:20, v/v) + 0,3% de ácido fórmico e 0,1% de trietilamina, numa vazão de 1,5 mL min-1 e por LC-MS utilizando a mesma fase estacionária e a fase móvel composta por 96% de metanol em água + 0,2% de ácido acético e 0,1% de acetato de amônio na vazão de 1 mL min-1. A extração dos analitos em meio de cultura líquido (Czapek, 2 mL) foi feita empregando a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME), nas condições: solvente dispersor,isopropanol (600 µL); solvente extrator, diclorometano (50 µL); reagente par iônico, di(2-etil-hexil)fosfato (100µL); e solução tampão fosfato de sódio (2 mL, pH 7,6). A recuperação do bambuterol foi de 92% e a da terbutalina foi estimada em 55%. O método foi validado para a análise do bambuterol no meio de cultura e se mostrou linear na faixa de concentração 500 17500 ng mL-1 para cada enantiômero (r > 0.998).O limite de quantificação foi igual a 500 ng mL-1. Dentre os fungos avaliados neste trabalho, nenhum foi capaz de realizar a biotransformação do bambuterol em terbutalina nas condições empregadas. Nos estudos feitos utilizando catálise assimétrica também não foi possível observar esse metabólito. Dada a complexidade do metabolismo do bambuterol (reações de hidrólise e/ou oxidação) e da formação de vários intermediários anterior a etapa de formação da terbutalina, as condições avaliadas nesse estudo não foi capaz de produzir o metabólito ativo do bambuterol, terbutalina.
Titre en anglais
Evaluation of fungi and salen complexes in the obtention of the chiral and active metabolite terbutaline
Mots-clés en anglais
Bambuterol
Biotransformation
DLLME.
Enantioseparation
Terbutaline
Resumé en anglais
Enantiomers may interact differently in the organism causing pharmacological sundry effects. For these reason, enantiomeric pure drugs are very important for the pharmaceutical industries. Synthetic models employing chiral reagents, like salen complexes, and biological models using fungi are been very studied in this context. Fungi present as main advantage the fast growing up, low costs and easily application, moreover, their metabolites are produced in huge quantities. Salen complexes are efficient and stable. They have a wide application and the possibility of production of high enantiomeric excess. The aim of this work was to evaluate fungi and salen complex as alternatives to the enantioselective production of terbutaline, the chiral and active metabolite of your prodrug, bambuterol. The analytes enantioselective separation was done employing high performance liquid chromatography with UV-Vis detector (LC/UV). The method validation and the studies of biotransformation were done using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS). The resolution of bambuterol and terbutaline by LC/UV was accomplished using the Chirobiotic T column and acetonitrile: methanol (80:20, v/v) + 0.3% formic acid and 0.1% triethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and by LC-MS employing the same column and the mobile phase was composed by 96% of methanol in water + 0,2% acetic acid and 0,1% ammonium acetate at a flow rate of 0.1 mL min-1. The analytes extraction of the culture medium (Czapek, 2 mL) was done using the dispersive liquid liquid microextraction (DLLME), in the following conditions: dispersive solvent, isopropanol (600 µL); extractor solvent, dichloromethane (50 µL); ionic-pair reagent; di(2-ethylhexyl)phosphate (100 µL); and sodium phosphate buffer (2 mL, pH 7.6). The recoveries were 92% for the bambuterol and estimated in 55% for terbutaline. The method was validated for the analysis of bambuterol in the culture medium and was linear over the concentration range of 500 17500 ng mL-1 for each enantiomer (r > 0.998). The quantification limit was 500 ng mL-1. Among the evaluated fungi, none was able to do the biotransformation process of bambuterol at terbutaline in the employed conditions and so do the studies employing asymmetric catalyses. Because the complexity of bambuterols metabolism for producing terbutaline (hydrolysis and/or oxidation reactions) and the formation of several intermediates before the terbulalines formation step, the evaluated conditions in this study were not able to produce the chiral active metabolite, terbutaline.
 
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Date de Publication
2014-01-14
 
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