• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.59.2002.tde-02022007-121223
Documento
Autor
Nome completo
Douglas Chodi Masui
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2002
Orientador
Banca examinadora
Leone, Francisco de Assis (Presidente)
Aoyama, Hiroshi
McNamara, John Campbell
Título em português
Caracterização cinética da (Na+, K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE)
Palavras-chave em português
(Na+/K+)-ATPase
Callinectes danae
Excreção de íons amônio
Osmorregulação
Resumo em português
A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos.
Título em inglês
Kinetic characterization of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the swimming crab Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE).
Palavras-chave em inglês
(Na+/K+)-ATPase
ammonium ions excretion
Callinectes danae
Osmoregulation
Resumo em inglês
The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
siginifica que o arquivo pode ser somente acessado dentro da Universidade de São Paulo.
Data de Publicação
2007-02-26
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2020. Todos os direitos reservados.