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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.59.2020.tde-12092019-160956
Documento
Autor
Nombre completo
Milene Mantovani Mata
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2019
Director
Tribunal
McNamara, John Campbell (Presidente)
Augusto, Alessandra da Silva
Bitondi, Marcia Maria Gentile
Hartfelder, Klaus Hartmann
Klein, Wilfried
Leone, Francisco de Assis
Título en portugués
Uma abordagem molecular do papel de ionotransportadores branquiais na regulação osmótica e iônica de crustáceos hololimnéticos de água doce
Palabras clave en portugués
Brachyura
Brânquias
Crustacea
Decapoda
Expressão gênica
Expressão proteica
Hiper-osmorregulação
Hipo-osmorregulação
Ionotransportadores
Osmorregulação
Palaemonidae
Regulação iônica
Resumen en portugués
Pela sua diversidade e por ocuparem a maioria dos habitats disponíveis no planeta, o grupo dos crustáceos é ideal para a reconstrução da história evolutiva da osmorregulação. As espécies de meios diluídos ou de água doce enfrentam intenso influxo osmótico de água e perda de sal pela superfície corporal, minimizados por poderosos mecanismos de hiperosmorregulação. Os principais processos que atuam na homeostase osmótica e iônica são a Regulação Isosmótica Intracelular (RII) e, particularmente, a Regulação Anisosmótica Extracelular (RAE). Na RII, a composição e o volume do fluido intracelular são conservados, devido ao transporte de íons pelo simportador Na+/K+/2Cl- pela Na+/K+-ATPase, e principalmente pela síntese e/ou degradação de aminoácidos e peptídeos. Na RAE, a osmolalidade, a concentração iônica e o volume do fluido extracelular ou hemolinfa são mantidos próximos àqueles do fluido intracelular, pela atuação das proteínas ionotransportadoras Na+/K+-ATPase e V(H+)-ATPase, do simportador Na+/K+/2Cl-, canais iônicos, que participam da captura e reabsorção de sal em meio hiposmótico, como a água doce, e da secreção de sal em meio hiperosmótico. Estas proteínas estão localizadas em células branquiais altamente diferenciadas, denominadas ionócitos. O presente trabalho buscará avaliar a regulação osmótica e iônica em nível sistêmico e molecular, utilizando dois crustáceos hololimnéticos de água doce, frente a desafios osmóticos e iônicos. Selecionamos espécies filogeneticamente distantes, o caranguejo braquiúro Dilocarcinus pagei e o camarão carídeo Macrobrachium jelskii, a fim de avaliar seus mecanismos osmorregulatórios, e se estes permitiram a ocupação de água doce em eventos independentes. Espécimes de D. pagei foram coletados em riachos de Sertãozinho, região nordeste do estado de São Paulo, Brasil. Após aclimatização em laboratório, os caranguejos foram submersos em água destilada (0 S) ou salobra (25 S), constituindo desafios hipo- ou hiper-osmóticos, respectivamente, por tempos determinados de até 10 dias. Parâmetros sistêmicos como a osmolalidade, a [Na+] e a [Cl-] da hemolinfa foram avaliados, sendo observado aumento ao longo do decurso temporal em água a 25 S. Em água destilada, obtivemos resultados inéditos, com pequeno aumento da osmolalidade apenas nos momentos iniciais de exposição, sem variações na [Cl-] e com diminuição da [Na+] da hemolinfa após 24 horas. Parâmetros moleculares, como a expressão gênica dos ionotransportadores Na+/K+-ATPase, V(H+)-ATPase e Na+/K+/2Cl-, mostraram diminuição em água a 25 S. Em água destilada, houve diminuição da expressão gênica da Na+/K+-ATPase a partir de 24 h de exposição. Os exemplares de M. jelskii foram coletados na via fluvial do Clube Náutico de Araraquara, região central do estado de São Paulo, Brasil. Após aclimatização em laboratório, os camarões foram submersos em água destilada (0 S) ou salobra (20 S), por tempos determinados de até 12 horas ou 10 dias,respectivamente. Parâmetros sistêmicos (osmolalidade, [Na+] e [Cl-] da hemolinfa) aumentaram ao longo do decurso temporal em água a 20 S. Em água destilada, houve diminuição desses parâmetros até o tempo de 12 horas, a partir do qual os camarões não sobreviveram. Parâmetros moleculares revelaram aumento da expressão gênica das proteínas Na+/K+-ATPase, V(H+)-ATPase e Na+/K+/2Cl- em água a 20 S. Em água destilada, a expressão gênica da V(H+)-ATPase e do simportador Na+/K+/2Cl- também aumentou até 12 horas. Ainda, análises de expressão proteica para Na+/K+-ATPase e Na+/K+/2Cl- foram realizadas, mas os resultados não apresentaram forte correlação com as respectivas expressões gênicas. Para ambas as espécies, construímos fenogramas com as sequências parciais das regiões codificadoras das proteínas de interesse, que nos revelaram informações sobre a evolução de suas sequências gênicas. Os dados apresentados aumentam o conhecimento acerca da fisiologia e biologia molecular dos mecanismos osmorregulatórios em D. pagei e M. jelskii, duas espécies muito distantes que habitam o mesmo biótopo, revelando respostas divergentes quanto ao enfrentamento de desafios osmóticos semelhantes. O conjunto de dados e suas análises contribuem para um melhor entendimento dos processos que levaram à ocupação da água doce pelos crustáceos decápodes
Título en inglés
A molecular analysis of the role of gill ion transporters in osmotic and ionic regulation by freshwater hololimnetic crustaceans
Palabras clave en inglés
Brachyura
Crustacea
Decapoda
Gene expression
Gills
Hyper-osmoregulation
Hypo-osmoregulation
Ion transporters
Ionic regulation
Osmoregulation
Palaemonidae
Protein expression
Resumen en inglés
Because of their diversity, and since they occupy most of the habitats available on the planet, the crustaceans are ideal for reconstructing the evolutionary history of osmoregulation. Species that live in dilute or freshwater media face intense osmotic influx of water and loss of salt across the body surfaces, minimized by powerful mechanisms of hyper-osmoregulation. The main processes that underlie osmotic and ionic homeostasis are Isosmotic Intracellular Regulation (IIR) and, in particular, Anisosmotic Extracellular Regulation (AER). In IIR, the composition and volume of the intracellular fluid are conserved, due to ion transport by the Na+/K+/2Cl- symporter and Na+/K+-ATPase, and by the synthesis and/or degradation of amino acids and peptides. In AER, the osmolality, ionic concentration and volume of the extracellular fluid or hemolymph are kept close to those of the intracellular fluid, by the action of ionotransporter proteins such as the Na+/K+-ATPase and V(H+)-ATPase, the Na+/K+/2Cl- symporter and ion channels, which enable the capture and resorption of salt in hyposmotic medium, such as fresh water, and salt secretion in hyperosmotic medium. These membrane proteins are located in highly differentiated gill cells, known as ionocytes. The present study will seek to appreciate osmotic and ionic regulation at the systemic and molecular levels, using two freshwater hololimnetic crustaceans exposed to osmotic and ionic challenges. We selected phylogenetically distant species, the brachyuran crab Dilocarcinus pagei and the caridean shrimp Macrobrachium jelskii, in order to evaluate their osmoregulatory mechanisms, and whether these have allowed the occupation of fresh water through independent events. Specimens of D. pagei were collected in streams near Sertãozinho in the northeast region of the State of São Paulo, Brazil. After acclimatization in the laboratory, the crabs were maintained submerged in distilled (0 salinity [S]) or brackish water (25 S), constituting hypo- or hyperosmotic challenges, respectively, for up to 10 days. Systemic parameters such as the osmolality, [Na+] and [Cl-] of the hemolymph were evaluated, and showed an increase over the time in medium of 25 S. In distilled water, we obtained novel results, showing a small increase in hemolymph osmolality during the initial exposure times, with no change in [Cl-], and a decrease in hemolymph [Na+] after 24 hours. Molecular parameters such as the gene expression of the Na+/K+-ATPase, V(H+)- ATPase and the Na+/K+/2Cl- decreased when in medium of 25 S. In distilled water, Na+/K+- ATPase gene expression decreased after 24 h exposure. Specimens of the M. jelskii were collected at the Clube Náutico de Araraquara, in the central region of the State of São Paulo, Brazil. After acclimatization in the laboratory, the shrimps were submerged in distilled (0 S) or brackish water (20 S), for up to 12 hours or 10 days, respectively. Systemic parameters (hemolymph osmolality, [Na+] and [Cl-]) increased with exposure time in medium of 20 S. In distilled water, these parameters decreased up to 12 hours, after which the shrimps did not survive. Molecular parameters revealed increased gene expression of the Na+/K+-ATPase, V(H+)-ATPase and the Na+/K+/2Cl- ionotransporter proteins in medium of 20 S. In distilled water, the gene expression of V(H+)-ATPase and the Na+/K+/2Cl- symporter also increased up to 12 hours. Further, protein expression analyses for the Na+/K+-ATPase and the Na+/K+/2Cl- did not show a strong correlation with their respective gene expressions. For both species, we constructed phenograms with the partial cDNA sequences of the coding regions of the proteins of interest, which revealed useful information of the evolution of their gene sequences. The data presented increase our knowledge of the physiology and molecular biology of osmoregulatory mechanisms in D. pagei and M. jelskii, two very distant species that inhabit the same biotope, revealing divergent responses to similar osmotic challenges. The datasets obtained and their analyses contribute to a better understanding of the processes that have led to the occupation of fresh water by the decapod Crustacea
 
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Fecha de Publicación
2020-01-14
 
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