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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2018.tde-02052016-161314
Document
Author
Full name
Tiago Sampaio de Sousa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2015
Supervisor
Committee
Vilela, Suely (President)
Beleboni, Renê de Oliveira
Spadaro, Augusto Cesar Cropanese
Title in Portuguese
Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor recombinante de miotoxinas, do tipo-?, da serpente Bothrops alternatus
Keywords in Portuguese
aPLI
Bothrops alternatus
Caracterização bioquímica
Inibição de miotoxicidade
Inibidor de Fosfolipase A2
Miotoxinas
rBaltMIP
Abstract in Portuguese
Fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas abundantes em peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, possuindo uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como miotóxico, causador de necrose muscular. Em busca de novos fármacos de interesse médico e científico, os inibidores de fosfolipases A2 (PLIs) tornaram-se importantes alvos de pesquisa nos últimos anos. Tendo isto em vista, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de fosfolipase A2 miotóxica do tipo alfa (?BaltMIP) de B. alternatus em sua forma recombinante. Para os estudos de neutralização funcional foram utilizadas as toxinas da peçonha de Bothrops jararacussu: Lys49 PLA2-símile BthTX-I e a Asp49 PLA2 BthTX-II. O processo de purificação das toxinas de B. jararacussu consistiu em dois passos cromatográficos: exclusão molecular seguida de troca iônica, sendo o grau de pureza avaliado por HPLC. A expressão heteróloga do inibidor recombinante ?-BaltMIP foi induzida em leveduras Pichia pastoris. O inibidor purificado, denominado rBaltMIP, apresentou-se como uma proteína pura com pI de 5,8, massa molecular de ~21 kDa por SDS-PAGE e 19,5 kDa por MALDI/TOF MS e com conteúdo de carboidratos de 10%. Após o sequenciamento dos peptídeos trípticos obtidos, os resultados foram comparados com outros ?PLIs depositados em bancos de dados, observando-se 100% de identidade entre o rBaltMIP e o seu inibidor nativo ?BaltMIP, e de 92 a 96% com os demais inibidores analisados. Para as toxinas BthTX-I e BthTX-II, as concentrações efetivas (CE50) para as atividades miotóxicas medidas através dos níveis plasmáticos de CK foram de 0,1256 ?g/?L e de 0,6183 ?g/?L, respectivamente, e quando incubadas com o rBaltMIP houve neutralização de até 65% da miotoxicidade induzida por estas enzimas. Já nos ensaios de formação de edema de pata, foram obtidas as CE50 de 0,02581 ?g/?L e 0,02810 ?g/?L, respectivamente, com neutralização do edema pelo rBaltMIP de até 40%, mostrando-se um inibidor viável para complementar a soroterapia antiofídica sem, no entanto, ser imunogênico. Reforçando esta hipótese, experimentos de neutralização da miotoxicidade feitos com a miotoxina BthTX-I mostraram que o rBaltMIP foi mais eficiente em inibir os danos musculares que o próprio soro antiofídico quando usado isoladamente. Assim, devido a gravidade dos envenenamentos e a baixa neutralização de seus efeitos locais, como a miotoxicidade, pelo soro antiofídico usado atualmente, o estudo do rBaltMIP como inibidor de PLA2s do grupo II de serpentes torna-se promissor devido às suas possíveis aplicações clínicas, podendo neutralizar com maior rapidez, eficiência e especificidade as ações tóxicas de peçonhas ofídicas.
Title in English
Biochemical and functional characterization of a recombinant alpha-type myotoxin inhibitor from Bothrops alternatus snake
Keywords in English
aPLI
Biochemical characterization
Bothrops alternatus
Myotoxin inhibitor
Myotoxins
Phospholipase A2 inhibitor
rBaltMIP
Abstract in English
Phospholipases A2 are abundant enzymes present in Bothrops venoms which have a wide variety of pharmacological and/or toxic effects, such as myotoxicity, related to muscle necrosis. In search for new drugs of medical and scientific interest, the phospholipase A2 inhibitors (PLls) have become important targets in recent years. Considering this, the present study aimed at the biochemical and functional characterization of an alpha type phospholipase A2 inhibitor (?-BaltMIP) from B. alternatus in its recombinant form. For the functional neutralization studies, toxins from Bothrops jararacussu venom were used: Lys49 PLA2-like BthTX-I and Asp49 PLA2 BthTX-II. The process of purification of B. jararacussu toxins consisted of two chromatographic steps: molecular exclusion followed by ion exchange, evaluating their purity by HPLC. The heterologous expression of the recombinant ?BaltMIP inhibitor was induced in Pichia pastoris yeast. The purified inhibitor, called rBaltMIP, presented itself as a pure protein with pI of 5.8, molecular mass of ~21 kDa by SDS-PAGE and 19.5 kDa by MALDI/TOF MS, with 10% carbohydrate content. After tryptic peptides sequencing, the results were compared with other ?PLIs deposited in databases, observing a 100% identity between rBaltMIP and its native inhibitor ?BaltMIP, and from 92 to 96% identity with the other analyzed inhibitors. Toxins BthTX-I and BthTX-II showed effective concentrations (EC50) for myotoxic activities measured via plasma CK levels of 0.1256 ?g/?L and 0.6183 ?g/?L, respectively, and incubation with rBaltMIP indicated neutralization of up to 65% of myotoxicity. In paw edema formation assays, EC50 of 0.02581 ?g/?L and 0.02810 ?g/?L, respectively, were observed, with edema neutralizations of up to 40% by rBaltMIP, showing viability to complement antivenoms without, however, being immunogenic. Reinforcing this hypothesis, myotoxicity neutralization experiments performed with the myotoxin BthTX-I showed that rBaltMIP was more effective in inhibiting muscle damage than the actual antivenom by itself. Thus, considering the severity of envenomations and the low neutralization of their local effects, such as myotoxicity, by the antivenoms currently used, the study of rBaltMIP as a PLA2 inhibitor becomes promising due to its possible clinical applications, neutralizing quickly and with more efficiency and specificity the toxic actions of venoms
 
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Release Date
2020-07-30
Publishing Date
2018-07-30
 
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