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Thèse de Doctorat
DOI
Document
Auteur
Nom complet
Camila Marchioni
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2019
Directeur
Jury
Nassur, Maria Eugenia Queiroz (Président)
Augusto, Fabio
Gaitani, Cristiane Masetto de
Hallak, Jaime Eduardo Cecilio
Lanças, Fernando Mauro
Rocha, Eduardo Carasek da
Titre en portugais
Determinação de endocanabinóides e canabinóides em amostras biológicas de pacientes com a doença de Parkinson por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem
Mots-clés en portugais
2-araquidonilglicerol
9- tetraidrocanabinol
Anandamida
Canabidiol
Doença de parkinson
In-tube SPME
Polímero molecularmente împresso
UHPLC-MS/MS no modo column switching
Resumé en portugais
Os endocanabinóides são neurotransmissores derivados do ácido araquidônico que se ligam aos receptores canabinóides participando de diversas funções cerebrais, tais como memória, aprendizado e controle motor. Os principais endocanabinóides são a anandamida (AEA) e o 2-araquidonilglicerol (2-AG). A Doença de Parkinson (DP) é considerada a segunda patologia neurodegenerativa mais comum na população, sendo caracterizada pela redução da influência dopaminérgica. Indícios mostram um aumento de AEA e uma diminuição nos níveis de 2-AG em pacientes portadores da DP e em modelos animais induzidos ao parkinsonismo. O canabidiol (CBD) é um promissor fármaco para o tratamento da DP, pois acredita-se que apresenta um efeito neuroprotetor na degeneração de neurônios dopaminérgicos. Entretanto, o uso do ?9-Tetraidrocanabinol (?9-THC) não é indicado, pois pode apresentar efeitos psicotrópicos e dependência. A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-MS/MS) tem sido considerada a técnica analítica de referência para a determinação de endocanabinóides e canabinóides em amostras biológicas. A cromatografia líquida no modo column switching permite a automação das análises através da hifenação da etapa de preparo de amostras biológicas (pré-concentração dos analitos e remoção de grande parte dos componentes endógenos) com o sistema cromatográfico (separação cromatográfica e detecção). Neste contexto, dois métodos analíticos online utilizando o UHPLC-MS/MS no modo column switching foram desenvolvidos para determinação de (a) AEA e 2-AG; (b) CBD e ?9-THC em amostras biológicas de pacientes com DP. Os endocanabinóides foram determinados em amostras de plasma e de líquido cefalorraquidiano (LCR). O método UHPLC-MS/MS no modo column switching para determinação dos endocanabinóides com uma coluna de material de acesso restrito na primeira dimensão apresentou linearidade entre 0,100 (LIQ) a 6,00 ng mL-1 para AEA e 0,04 (LIQ) a 10,00 ng mL-1 para 2-AG nas amostras de plasma. Para as amostras de LCR a faixa linear foi de 0,45 (LIQ) a 9,00 ng mL-1 para AEA e 1,40 (LIQ) a 180 ng mL-1 para o 2-AG. Os valores de exatidão ficaram abaixo de 14,2% e de precisão abaixo de 11,1% (excluindo LIQ) para os dois analitos. Os métodos não apresentaram efeito residual e nem efeito matriz. Os analitos mostraram ser estáveis após ciclos de congelamento/descongelamento e no teste a curto e longo prazo. Estes métodos foram empregados para análise 70 amostras de plasma e 66 de LCR. Para a determinação (UHPLC-MS/MS no modo column switching) de CBD e ?9-THC em amostras de plasma foi sintetizada a fase molecularmente impressa (MIP) monolítica em capilar de sílica fundida (in situ). A síntese apresentou boa rentabilidade utilizando pequena massa da molécula molde (CBD reduzido). O método online, utilizando o capilar MIP na primeira dimensão, apresentou linearidade entre 10 e 300 ng mL-1 (CBD e ?9-THC). A precisão variou entre 0,2 e 10,3% para os dois analitos e a exatidão foi inferior a 4,4% (excluindo o LIQ). O efeito residual e o efeito matriz ficaram dentro dos parâmetros estabelecidos pela ANVISA. Por fim, o método foi aplicado satisfatoriamente na determinação de CBD e ?9-THC em amostras de plasma de pacientes em terapia com CBD
Titre en anglais
Determination of endocannabinoids and cannabinoids in biological samples from patients with Parkinson`s disease by ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Mots-clés en anglais
2-arachidonoylglycerol
?9- Tetrahydrocannabinol
Anandamide
Cannabidiol
Column switching UHPLC-MS/MS
In-tube SPME
Moleculary imprinted polymer
Parkinson's disease
Resumé en anglais
Endocannabinoids are neurotransmitters derived from arachidonic acid; they bind to cannabinoid receptors and participate in various brain functions, such as memory, learning, and motor control. Anandamide (AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG) are the main endocannabinoids. Parkinson's disease (PD) is considered the second most common neurodegenerative pathology in the population, being characterized by reduced dopaminergic influence. Evidence shows an increase in AEA and a decrease in 2-AG levels in patients with PD and in animal models with induced parkinsonism. Cannabidiol (CBD) is a promising drug to treat PD: it is believed to have a neuroprotective effect on dopaminergic degeneration. However, the use of ?9- Tetrahydrocannabinol (?9-THC) is not indicated because it may lead to psychotropic effects and dependence. High-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) has been considered the benchmark analytical technique to determine endocannabinoids and cannabinoids in biological samples. Column switching allows analysis to be automated through hyphenation of the biological sample preparation stage (analytes pre-concentration and removal of most endogenous components) with the chromatographic system (chromatographic separation and detection). In this context, we have developed two online analytical methods based on UHPLC-MS/MS in the column switching mode to determine (a) AEA and 2-AG and (b) CBD and ?9-THC in biological samples from patients with PD. Endocannabinoids were determined in plasma and cerebrospinal fluid (CSF) samples. The UHPLC-MS/MS method in the column switching mode for determination of endocannabinoids with a column of restricted access material in the first dimension showed linearity between 0.100 (LIQ) and 6.00 ng mL-1 for AEA and 0.04 (LIQ) to 10.00 ng mL-1 for 2-AG in plasma samples. For CSF samples, the linear range was from 0.45 (LIQ) to 9.00 ng mL-1 for AEA and from 1.40 (LIQ) to 180 ng mL-1 for 2-AG. The accuracy values were below 14.2% and precision below 11.1% (excluding LIQ) for the two analytes. The methods had no residual effect or matrix effect. The analytes were stable after freeze/thaw cycles and in the short- and long-term test. These methods were used to analyze 70 plasma and 66 CSF samples. To determine CBD and ?9-THC in plasma samples (UHPLC-MS/MS in column switching mode), we synthesized a molecularly imprinted polymer (MIP) in the fused silica capillary (in situ). The synthesis showed good profitability because it required small mass of the template molecule (reduced CBD). The online method based on the MIP capillary in the first dimension showed linearity between 10 and 300 ng mL-1 (CBD and ?9-THC). Precision ranged from 0.2 to 10.3% for the two analytes and the accuracy was less than 4.4% (excluding LIQ). The residual effect and the matrix effect were within the parameters established by ANVISA. Finally, the method was satisfactorily applied to determine CBD and ?9-THC in plasma samples from patients on CBD therapy
 
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Date de Libération
2021-05-23
Date de Publication
2019-11-21
 
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