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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.60.2007.tde-31072009-083151
Documento
Autor
Nome completo
Raquel de Melo Alves
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2007
Orientador
Banca examinadora
Vilela, Suely (Presidente)
Giglio, Jose Roberto
Valim, Yara Maria Lucisano
Título em português
Isolamento e caracterização bioquímica e funcional de L-aminoácido oxidase do veneno de 'Bothrops atrox'
Palavras-chave em português
apoptose.
atividade citotóxica
Bothrops atrox
L-aminoácido oxidase
Resumo em português
Os venenos de serpentes são ricos em proteínas, enzimas e peptídeos biologicamente ativos. Diversas enzimas tais como fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases (MP), L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis pelo quadro clínico do envenenamento ofídico. Atualmente, o isolamento e a caracterização funcional e estrutural destas enzimas têm auxiliado na compreensão do mecanismo de ação destas toxinas e nas formas alternativas de tratamento. Além disso, estas enzimas se tornaram valiosas ferramentas de aplicação biotecnológica, na busca de novos fármacos de interesse na clínica médica. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente a L-aminoácido oxidase do veneno de Bothrops atrox. O isolamento da LAAO de B. atrox (LAAOBatrox) envolveu três etapas cromatográficas: a exclusão molecular em Sephadex G-75, troca iônica em ES-502N utilizando CLAE e, por último, a cromatografia de afinidade com uso da Lentil-Lectina, conferindo um alto grau de pureza à proteína confirmado por SDS-PAGE. Após a caracterização bioquímica, a LAAOBatrox demonstrou ser uma glicoproteína com 12% de açúcar, massa molecular relativa de 67.000 e pI de 4,4 confirmando seu caráter ácido pela composição em aminoácidos, predominando Asx (Ácido aspártico ou asparagina) e Glx (Ácido glutâmico ou glutamina). LAAOBatrox apresentou especificidade de substrato para L-Met e L-Leu. Com o seqüenciamento dos peptídeos trípticos internos e em comparação com as LAAOs de outros venenos, a LAAOBatrox apresentou homologia de 100% com LAAOs isoladas de B. moojeni e B. jararacussu e apresentou sequenciamento N-terminal de ADDN-NPLEE-NIRRDD que é homólogo ao das LAAOs já descritas. A LAAOBatrox apresentou atividade edematogênica moderada quando comparada ao veneno bruto, atividade coagulante baixa sobre o plasma humano citratado, atividade de agregação plaquetária sendo que 25µg/mL foi capaz de agregar aproximadamente 100% de plaquetas, onde o efeito obtido pela proteína pode ser devido à liberação de H2O2, sendo que a catalase foi adicionada ao meio tratado com LAAOBatrox e o efeito de agregação plaquetária obtido foi próximo à 0%. LAAOBatrox apresentou efeito citotóxico sobre diferentes linhagens tumorais: B16F10 onde as células apresentaram 70% de morte por apoptose e PC12 que apresentaram uma viabilidade celular de 20% após o tratamento com a enzima. LAAOBatrox não apresentou efeito citotóxico significativo sobre células normais. Portanto, a LAAOBatrox consiste de uma enzima multifuncional que poderá servir como ferramenta para investigação dos processos celulares que estão envolvidos no envenenamento.
Título em inglês
Isolation and characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops atrox snake venom
Palavras-chave em inglês
apoptosis
Bothrops atrox
cytotoxic activity
L-amino acid oxidase
Resumo em inglês
Snake venoms are rich in proteins, enzymes and biological active peptides. Many enzymes, like phospholipases A2, metalloproteinases, L-amino acid oxidases are responsible by clinical aspects of ophidian poisoning. Nowadays, isolation and the functional and structural characterizations of these enzymes have been useful to elucidate their mechanisms of action. Besides, these enzymes have great value for biotechnology on searching of new molecules for medicine development. The aim of this work was isolate Lamino acid oxidase from B. atrox venom (LAAOBatrox) and characterize biochemical and functionally LAAOBatrox. The isolation consisted of 3 chromatographic steps: molecular exclusion using a G-75 Sephadex column, ion exchange using ES-502N column in HPLC and affinity chromatography with Lentil-Lectin column. Afterward, LAAOBatrox was analyzed by SDS-PAGE to confirm an expected high purity level. Biochemical characterization showed LAAOBatrox is a glycoprotein of 12% sugar-containing with relative molecular weight of 67000, pI estimated in 4,4 pointing to acid character due to its amino acids composition, rich for Asx and Glx residues. LAAOBatrox displays high specificity to hydrophobic L-amino acids (best substrates: L-Met and L-Leu). The Nterminal amino acid sequence (ADDN-NPLEE-NIRRDD) and the internal peptide sequences showed close structural homology to other snake venom L-amino acid oxidades, presenting 100% homology to LAAO from B. moojeni and B. jararacussu. This enzyme induces moderate edema compared to crude venom, low coagulating activity in human plasma and 100% of in vitro platelet aggregation induction with 25 g/mL, but this can be due to H2O2 production by LAAOs once added catalase has inhibited aggregation induced by LAAOBatrox and the effect was close to 0%. LAAOBatrox presents citotoxicity effect for tumor cell lines: 70% of death by apoptosis in B16F10 and 20% cellular viability for PC12, after LAAOBatrox treatment. LAAOBatrox did not display citotoxicity effect in normal cells (peripheral blood mononuclear cells). Thus, LAAOBatrox is a multifunctional enzyme of huge potential for investigation of cellular processes involved on poisoning and also for developing new medicines.
 
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dissertacao.pdf (1.33 Mbytes)
Data de Publicação
2009-09-25
 
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